Skip to main content

Metoder til analyse af biomolekyler ved hjælp af rullende DNA-cirkler

Cand.scient. Jakob Schwalbe Lohmann: Forf.s adresse: Laboratoriet for Molekylær Patologi, Patologisk Institut, Århus Universitetshospital, Nørrebrogade 44, DK-8000 Århus C. E-mail: jlohm@as.aaa.dk Forsvaret fandt sted den 18. januar 2008. Bedømmere: Thomas Ledet, Niels Tommerup og Eigil Kjeldsen . Vejledere: Lektor Jørn Koch og professor Stephen Hamilton-Dutoit.

18. jan. 2008
2 min.

Det eksperimentelle arbejde, der danner grundlag for denne ph.d.-afhandling, er hovedsageligt blevet udført i laboratoriet for Molekylær Patologi, Patologisk Institut, Aarhus Universitetshospital. Projektet bygger på en bevilling under EU's 6. rammeprogram Moltools (www.moltools.org). Formålet med projektet var at udvikle nye metoder til detektion af enkelt-molekyler i celle- og vævspræparationer. Dette skulle gøres ved at bruge en speciel amplifikations-teknik, der benytter små enkeltstrengede DNA-cirkler (ca. 100 nukleotider). Når sådanne cirkler er blevet dannet, kan de amplificeres meget kraftigt ved hjælp af en polymerase, og efterfølgende kan et amplifikationsprodukt detekteres med fluorescensmikroskopi. Resultaterne er blevet præsenteret i tre separate videnskabelige rapporter.

I den første del af projektet viste vi, at man kan detektere to repeterede genomiske sekvenser på kromosom-spredninger ved hjælp af såkaldte padlock -prober og rullende cirkler. De to sekvenser var henholdsvis satellit I-sekvensen (DYZ1), der er placeret på den lange arm af Y-kromosomet, og det repeterede kringle IV-domæne i apolipoprotein(a)-genet, der er placeret på den lange arm af kromosom 6. Denne teknik er ikke tidligere blevet eftervist på kromosomspredninger. Dette studie er blevet publiceret i tidsskriftet BMC Molecular Biology.

I den anden del af projektet prøvede vi at forbedre de prober, der blev anvendt i det første studie, da kemisk syntetiserede DNA-prober sjældent har den samme kvalitet som enzymatisk syntetiserede prober. Vi har derfor udviklet en metode, der benytter en kombination af rullende cirkler samt restriktions- og nicking -enzymer til at producere padlock -prober. Dette studie er blevet publiceret i tidsskriftet BMC Biotechnology.

Rullende cirkler er tidligere blevet brugt til at detektere tilstedeværelsen af DNA, RNA og proteiner, men ikke til detektion af proteinaktivitet. I den tredje del af projektet har vi udviklet en metode til netop detektion af enzymaktivitet af DNA-modificerende enzymer. Som testproteiner har vi kigget på nukleasen Fen1 samt topoisomerase I. Metoden kan have store anvendelsesmæssige perspektiver, da det i mange henseender vil være hensigtsmæssigt at kigge på den enzymatiske aktivitet frem for alene at kigge på tilstedeværelsen af et protein. Dette gør sig gældende, da de fleste proteiner bliver reguleret efter syntesen og derved kan have forskellige enzymatiske aktiviteter afhængig af graden af regulering. Reguleringen kan ske både gennem interaktion med andre proteiner samt posttranslationelle modifikationer. Dette arbejde er indsendt men endnu ikke publiceret.