Statusrapport over udforskningen af Na,K-ATPase, Ca-ATPase og andre P-type-kationpumper

P-type-pumper er en familie af fem adskilte grupper (P-type ATPase-database: http://biobase.dk/~axe/Patbase.html), der omfatter Na,K-ATPase, gastrisk H,K-ATPase, Ca-ATPase i sarkoplasmatisk og endoplasmatisk reticulum, plasmamembran Ca-ATPase, og plasmamembran H-ATPase i svampe og højere planter. Desuden er der grupper af tungmetalpumper og fosfolipid-pumper. Forskningsfeltet har undergået fundamentale ændringer siden Jens Chr. Skou i 1957 [1] beskrev en ATPase fra krabbenerver, der var aktiveret af Na- og K-ioner. Over de sidste 30 år har konferencer om Na,K-pumpen samlet forskere inden for feltet for at præsentere nye data og diskutere den seneste udvikling. Den »10th International Conference on Na,K-ATPase and Related Cation Pumps« blev afholdt i Helsingør, 8.-13. august, 2002 med 247 aktive deltagere.

Især i de seneste to år har vi været vidner til en hurtig udvikling med publikation af den første krystalstruktur af en P-type kationpumpe, Ca-ATPase fra sarkoplasmisk reticulum ved 2,6 Å resolution i en E1 Ca-konformation [2]. For at forstå mekanismen bag den aktive kationtransport af enhver P-type-pumpe må vi vide, hvorledes proteinstrukturen ændres i de forskellige trin af den katalytiske cyklus. Et højdepunkt på mødet var præsentationen af en ny struktur ved 3,1 Å resolution af Ca-ATPase i en E2 -konformation, med bundet Mg og inhibitoren thapsigargin [3]. En sammenligning af strukturerne i E1 - og E2 -konformationerne giver en unik indsigt i mekanismen bag den aktive transport af Ca. Disse strukturer har også en enestående værdi for forståelse af struktur og funktion for alle P-type-pumper, og de gør det lettere at planlægge forsøg på at teste detaljer i mekanismerne bag de aktive transportprocesser. Ved konferencen blev den molekylære struktur og funktion af Na,K-ATPase, H,K-ATPases, H-ATPase og Ca-ATPase sammenlignet i flere symposier, og specielle sessioner blev afviklet for at diskutere tungmetalpumper og protonpumper i planter. Uanset at strukturerne ved høj resolution af Ca-ATPase har stor betydning for forståelsen af struktur og mekanisme for alle kationpumper, kan de ikke føre til en komplet løsning af pumpemekanismen for Na,K-ATPase og den gastriske og nongastriske H,K-ATPase, hvor der i tillæg er β -subunits eller regulatoriske subunits (FXYD-proteiner) som diskuteret nedenfor. Generelt kan vi nu se sammenhænge i struktur og funktion for alle P-type-kationpumper som et fælles problem, hvor vi søger efter generelle principper for overførsel af energi fra ATP-spaltning til bevægelse af kationer, selv om der er unikke strukturelle, funktionelle og regulatoriske træk ved hver enkelt gruppe af pumper. De videre fremskridt kræver en kombination af detaljeret funktionel analyse og i tillæg yderligere information om struktur, især nye krystalstrukturer af flere grupper af P-type-pumper.

Mekanismer for den fysiologiske regulering af Na,K-ATPase, Ca-ATPase og H,K-ATPase i den normale celles funktion og de patofysiologiske processer, der er involveret i human sygdom og farmakologi, er blevet et område af stor interesse, især set i lyset af de klassiske studier af struktur og funktion af kationpumper. Mere end det halve af konferencens tid blev brugt på disse områder, i sessioner over molekylære og fysiologiske mekanismer for regulering, hypertension og pumper som mål for farmaka. Som forventet for essentielle fysiologiske processer, som skaber Na- og K-gradienter over cellemembraner, eller Ca-gradienter over cellemembraner og sarko- eller endoplasmisk reticulum, er Na,K-ATPase og Ca-ATPase regulerede på flere niveauer af hormoner, vævsspecifikke isoformer, og små ionregulerende proteiner. Adskillige nye regulerende fænomener og nye metoder til at studere dem blev beskrevet. Især er der en udbredt anvendelse af transgene dyr til undersøgelse af de fysiologiske funktioner af isoformer af Na,K-ATPase og Ca-ATPaser (SERCA and PMCA) eller de regulatoriske proteiner (FXYD). Genekspression af Na,K-ATPase er celle- og vævsspecifik, således at α 1-isoformen udtrykkes konstitutivt i næsten alle væv, mens α 2-isoformen findes i muskler, hjerte og hjerne, α 3-isoformen i centralnervesystemet, og α 4-isoformen kun findes i spermatozooernes flagelmotor og således er afgørende for motiliteten. Ofte er homozygot knockout af de forskellige isoformer letale, men analyse af heterozygote knockout har givet interessante resultater. Således tyder nye data på, at α 2-isoformen af Na,K-ATPase er receptor for de positive inotrope effekter af hjerteglykosider, mens α 1-isoformen medierer de toksiske virkninger.

Studier af transgene mus og humane mutationer har opklaret de fysiologiske funktioner af mange isoformer af Ca-pumper. Plasmamembranens Ca-ATPase (PMCA) regulerer Ca i cytoplasma og PMCA1 er husholdningsisoformen, mens de tre andre isoformer har mere specielle funktioner. Mus med mutationer i PMCA2 er døve med defekt balance, der skyldes mangel på PMCA2 i de sensoriske hårceller i det indre øre. SERCA pumper Ca ind i sarkoplasmisk reticulum, og mutationer i SERCA1 hos mennesker fører til Brodys sygdom med langsom afslapning af skeletmuskler pga. forlængelse af den normale forhøjelse af Ca i muskelcellerne. SERCA2 pumper Ca ind i SR i hjertets muskelfibre, mens SERCA2b er ansvarlig for Ca-optagelsen i endoplasmatisk reticulum. Betaceller i pancreas udtrykker SERCA2b, der er involveret i den basale regulering af Ca i cytoplasma, mens SERCA3 er nødven-dig for de normale Ca-oscillationer som svar på glukosestimuli. I sig selv fører mangel på SERCA3 ikke til ændringer af homeostasen for glukose eller til defekt sekretion af insulin hos mus. Hos mus overlever SERCA2 nul-mutanter ikke, og heterozygote SERCA2-mutanter har nedsat kontraktilitet af hjertet og stor hyppighed af pladeepitelcellecancer. Der er her tale om den første påvisning af en direkte forbindelse mellem ændringer af Ca-homeostasen og udvikling af cancer. Hos mennesker kan mutationer af SERCA2 føre til Dariers sygdom med udvikling af neoplasier fra keratinocytter. Tab af en genkopi af SPCA1, der pumper Ca ind i Golgi, er årsag til Hailey-Hailey sygdom, en benign, men kronisk form for pemphigus med blæredannelse i huden.

Regulering af Na,K-ATPase af FXYD-familien af proteiner blev et stort fokus og et højdepunkt ved mødet. Disse proteiner med et enkelt transmembransegment, kaldet »FXYD« efter den konserverede signatursekvens, omfatter syv medlemmer (FXYD1-7), som udtrykkes vævsspecifikt. FXYD2 er den velkendte gammasubunit af den renale Na,K-ATPase, men indtil for nylig var dens funktion ukendt. Andre medlemmer som fosfolemman (FXYD1, PLM) eller CHIF (FXYD4) og FXYD7 udtrykkes i muskel (PLM), colon og nyrer (CHIF) eller hjerne (FXYD7) og blev tidligere opfattet som regulatorer af ionkanaler. Et meget centralt budskab ved mødet var, at alle disse proteiner er regulatorer af Na,K-ATPase og at de ved at ændre pumpens kinetik tilpasser dens funktionelle egenskaber til de specifikke krav i forskellige væv. Den vigtige fysiologiske rolle for disse proteiner illustreres af forbindelsen mellem en mutation af gammasubunit og hereditær primær renal hypomagnesæmi. Det er af lige så stor interesse, at der eksisterer en tilsvarende regulatorisk mekanisme for de kardiale SERCA Ca-ATPaser, som involverer proteiner med et enkelt transmembransegment, fosfolamban og sarcolipin.

Flere foredragsholdere diskuterede en anden og ny regulerende mekanisme, en rolle for Na,K-ATPase ved transduktion af signaler, særligt under vækst og hypertrofi af hjerteceller. De klassiske effekter af hjerteglykosider ved stimulation af hjertets kontraktilitet skyldes ændringer i de cellulære Na- og Ca-koncentrationer, og det foreslås nu, at ændringerne af ionkoncentrationerne medieres af α 2-isoformen af Na,K-ATPase og forekommer i et afgrænset område mellem hjertecellens membran og det sarkoplasmiske reticulum. I kontrast hertil kan langtidseffekten af ouabain ved stimulation af vækst involvere direkte interaktion af Na,K-ATPase med mange cellulære signaloverførsler og aktivering af transkriptionsfaktorer, som kontrollerer vækstrelateret genekspression. I en session over hypertension blev der præsenteret evidens for en fundamental rolle af mutationer i cytoskeletproteinet adducin for den genetiske mekanisme, som påvirker retentionen af Na og vand i nyrerne og for det endogene ouabain i de adaptive mekanismer, som korrigerer blodvolumen på bekostning af en forøget perifer modstand og en stigning af blodtrykket. Endelig blev der præsenteret nye principper for udvikling af farmaka til behandling af hypertension på basis af antagonister til det endogene ouabain. Nye strategier er også udviklet for hæmning af gastrisk H,K-ATPase ved behandling af ulcus og andre syrerelaterede sygdomme i mavesækken, hvor man omgår de kliniske begrænsninger ved brugen af de allerede kendte protonpumpehæmmere.

Et væsentligt organisatorisk aspekt af konferencen var, at et stort antal yngre forskere blev inviteret til at præsentere deres arbejde i foredragsform eller ved præsentation af postere. Bevilling fra det »5th Framework Programme of the European Commission for High Level Scientific Conferences« gjorde det muligt at uddele legater til dækning af rejse og deltagelse for mere end tredive yngre forskere fra Europa. Mange yngre forskere fra USA, Argentina, og Japan modtog også støtte til at præsentere væsentlige nye bidrag inden for forskningsområdet.

Foredrag ved konferencen og udvidede poster-abstracts er blevet publiceret i vol. 986 af »The Annals of The New York Academy of Sciences. Na,K-ATPase and Related Cation Pumps: Structure, Function and Regulatory Mechanisms«, som er udkommet i maj 2003 [4]) (Figur 1 ).

Korrespondance: Peter Leth Jørgensen , Biomembran Center, August Krogh Institutet, Københavns Universitet, Universitetsparken 13, DK-2100 København Ø. E-mail: pljorgensen@aki.ku.dk

Antaget: 28. januar 2004

Interessekonflikter: Ingen angivet