Ætiologi og patofysiologi ved insulinresistens og type 2-diabetes

Tvillingestudier har i mange år været anvendt til at belyse betydningen af arv versus miljø for ætiologien til en given fænotype inklusive type 2-diabetes. En række nyere studier har påvist en potentiel betydning af et uhensigtsmæssigt intrauterint miljø for udviklingen af insulinresistens, type 2-diabetes, hypertension og kardiovaskulær sygdom senere i livet. Idet monozygote og dizygote tvillinger i varierende grad udsættes for forskellige prænatale påvirkninger, er der stillet spørgsmålstegn ved validiteten af ætiologiske konklusioner i studier, der er baseret på den klassiske tvillingemodel, specielt hvad angår type 2-diabetes, insulinresistens, hypertension og kardiovaskulær sygdom. Imidlertid har vi samtidig fået en ny forståelse for, hvorledes man via tvillingestudier kan studere ætiologi og patofysiologi ved sygdomme med en mulig intrauterin komponent. Det forhold, at man også har kunnet opnå øget viden ved at studere tvillinger i molekylærbiologisk orienterede studier, hvor man fx har kunnet benytte resultaterne fra disse studier til at belyse sammenhænge mellem geno- og fænotype, samt til muskel-genekspressionsstudier, kan yderligere betyde, at tvillingestudier i fremtiden vil indtage en mere central plads i biomedicinsk forskning. I nærværende oversigt belyses ætiologien og patofysiologien til insulinresistens og type 2-diabetes ud fra en længere række af nyere epidemiologiske, metaboliske og molekylærbiologiske tvillingestudier.

.

Tvillingestudier har gennem årtier været anvendt til at belyse betydningen af arv versus miljø for ætiologien til en given fænotype inklusive diabetes mellitus. Den klassiske tvillingemodel udnytter det forhold, at monozygote (MZ) tvillinger har de samme gener, mens dizygote (DZ) tvillinger som søskende kun i gennemsnit har 50% genfællesskab. En forudsætning for validiteten af ætiologiske konklusioner, der er draget ud fra klassiske tvillingestudier, er imidlertid, at MZ- og DZ-tvillinger er under ens indflydelse af både præ- og postnatale miljømæssige faktorer. En række nyere studier har påvist en potentiel betydning af et uhensigtsmæssigt intrauterint miljø for udviklingen af type 2-diabetes, hypertension og kardiovaskulær sygdom senere i livet (1). Idet MZ- og DZ-tvillinger potentielt udsættes for forskellige prænatale påvirkninger, er der stillet spørgsmålstegn ved validiteten af ætiologiske konklusioner, der har været baserede på den klassiske tvillingemodel, specielt hvad angår type 2-diabetes, hypertension og kardiovaskulær sygdom. Imidlertid har vi samtidig fået en ny forståelse for, hvorledes man via tvillingestudier kan studere ætiologi og patofysiologi ved sygdomme med en mulig intrauterin komponent. Andre fejlkilder ved epidemiologiske tvillingestudier af insulinresistens og type 2-diabetes er selektiv rekruttering af tvillinger og fejlklassifikation af sygdomsstatus på grund af ikkeerkendt sygdom hos tilsyneladende raske tvillinger. Formålet med denne oversigt var at belyse ætiologien og patofysiologien til insulinresistens og type 2-diabetes ud fra en længere række af nyere epidemiologiske, metaboliske og molekylærbiologiske tvillingestudier.

Tvillingestudier har vist en betydning af både arv og miljø for udviklingen af type 2-diabetes og insulinresistens. Studier af monozygote tvillingepar, der er diskordante for type 2-diabetes, udgør et væsentligt redskab til at differentiere mellem sekundære (ikkegenetisk betingede) og primære (potentielt genetisk betingede) abnormiteter i glukosemetabolismen, heriblandt insulinresistens.

Tvillingeembryologi

Omtrent to tredjedele af alle tvillinger er DZ og udvikles efter befrugtning af to oozyter, hvorfor de ligesom andre søskende har forskellig genetisk konstellation. Normalt har hver DZ-tvilling sin egen amnionhinde, chorionhinde og placenta. Det kan forekomme, at DZ-tvillinger har sammenvoksede placentae, hvilket dog sjældent kompromitterer fosterets blodforsyning og ernæring. MZ-tvillinger udvikles fra et enkelt befrugtet æg og udgør ca. en tredjedel af alle tvillingegraviditeter. Tvillingegraviditeter er forbundet med en højere risiko for intrauterin underernæring, lav fødselsvægt og perinatal morbiditet og mortalitet sammenlignet med enkeltgraviditeter (3, 4). Herudover kan det forhold, at MZ-tvillinger deler ernæringskilde og udvikler vaskulære anastomoser resultere i et anderledes og potentielt mere uhensigtsmæssigt intrauterint miljø, end det DZ-tvillinger har, eftersom de har separate placentae.

Klassisk tvillingemetodologi

Forskel i en given fænotype mellem MZ-kotvillinger skyldes primært miljømæssige forhold, mens forskelle mellem DZ-tvillinger kan skyldes både genetiske og miljømæssige faktorer (5, 6). Der ses her bort fra, at meget sjældne somatiske mutationer kan give anledning til, at også MZ-tvillinger mht. genetisk baggrund kan være fænotypisk forskellige.

Ved klassisk tvillingemetodologi sammenlignes konkordansrater for sygdom mellem MZ- og DZ-tvillinger. Der skelnes mellem parvise og probandvise konkordansrater. Den parvise konkordansrate udtrykker andelen af afficerede tvillingepar, i hvilke begge tvillinger er afficerede, hvorimod den probandvise konkordansrate udtrykker andelen af afficerede individer blandt kotvillinger til en given proband.

I den klassiske tvillingemetodologi udtrykkes betydningen af gener for en given kontinuerlig variabel traditionelt som heritabilitetsestimater. Heritabilitetsestimater udtrykker andelen af den totale variation af et givent fænotypisk træk, som skyldes genetisk variation. Heritabilitetsbegrebet udtrykker primært additive genetiske effekter, idet dominante genetiske effekter samt epistasisfænomener formodes at være negligeable. Heritabiliteter kan estimeres ved at sammenligne ligheden af en given variabel inden for henholdsvis MZ- og DZ-tvillingspar ved interklasse- eller intraklassekorrelationer. Heritabiliten udtrykkes som to gange forskellen mellem interklasse- eller intraklasse-korrelationer for MZ- og DZ-tvillinger (h2=2[rmz -rdz ]). Således betyder en heritabilitetsværdi på 1,00, at den givne variabel er 100% genetisk bestemt, mens en heritabilitetsværdi på 0 betyder, at genetiske faktorer ikke har betydning for variablen.

Selektionsbias

Skæv eller selektiv rekruttering i tvillingestudier kan have stor betydning for de opnåede konklusioner med hensyn til den relative betydning af arv versus miljø for en given sygdom eller fænotype. Det er således vigtigt, at et indsamlet tvillingemateriale er repræsentativt for hele tvillingepopulationen i baggrundsbef olkningen. Rekrutteringen af tvillinger gennem annoncering kan medføre selektionsbias som følge af en teoretisk uforholdsmæssig stor rekruttering af konkordante og MZ-par (7-9). En fejlkilde ved klinikbaserede tvillingestudier er, at disse oftest inkluderer sværere sygdomstilfælde (diabetes) end svarende til forekomsten i baggrundspopulationen (10-13). Dette kan medføre en overestimering af de sande konkordansrater. Færrest rekrutteringsfejlkilder opnås ved at benytte populationsbaserede tvillingeregistre, hvilket frem for alt tillader rekruttering af tvillinger uafhængigt af sygdomsstatus (14-17).

I tvillingestudier har man påvist en betydning af lav fødselsvægt og et ikkegenetisk betinget uhensigtsmæssigt intrauterint miljø for senere udvikling af insulinresistens og type 2-diabetes.

Zygotibestemmelse

De metoder, som igennem tiden er blevet benyttet til at skelne mellem MZ- og DZ-tvillinger, inkluderer undersøgelse af føtalmembraner, fingeraftryk, fysisk lighed, sammenligning af blodtyper og benyttelse af genetiske markører (14). Ved store epidemiologiske undersøgelser benytter man oftest oplysninger fra tvillingerne om, hvorvidt de ligner hinanden »som to dråber vand«, og om hvorvidt de har været udsat for, at andre tog fejl af dem. Evalueret ved hjælp af genetiske markører giver denne metode anledning til en miskvalifikation på under 5% (18).

Diabetestype og diagnose

I de tidligste diabetestvillingestudier har der ikke været skelnet klart mellem type 1- og type 2-diabetes, hvilket i dag gør resultaterne fra disse studier svære at fortolke. I de seneste type 2-diabetes-tvillingestudier er der anvendt WHO-kriterier, såsom alder ved diagnosen, medicinering og grad af overvægt (9, 15-17). Et måske endnu væsentligere kritikpunkt af tidligere tvillingestudier er, at der oftest ikke systematisk er foretaget diagnostiske oral glukosetolerancetest (OGTT) blandt anamnestisk raske tvillinger. Dette kan have stor betydning for specielt type 2-diabetes-tvillingestudier, idet vi fra mange populationsstudier ved, at op til 50% af alle type 2-diabetes-tilfælde er udiagnosticerede primært pga. manglende subjektive symptomer. Således kan selv konkordansrater fra populationsbaserede tvillingestudier af type 2-diabetes være fejlagtige, såfremt diabetesdiagnosen kun bygger på selvrapporterede oplysninger. Yderligere kan dette medføre en overestimering af konkordansrater, idet kotvillinger til diabetiske probander i højere grad vil have ladet sig teste for asymptomatisk diabetes. Det er med udgangspunkt i disse hyppigt forekommende fejlkilder i tidligere tvillingestudier, at vi for nylig har foretaget en populationsbaseret tvillingeundersøgelse for både type 2-diabetes og dens forstadie, nedsat glukosetolerance, ved systematisk at foretage OGTT blandt tvillinger, der er født i Danmark i perioden 1921-1930 eller på Fyn i perioden 1931-1940 (17).

Arv versus miljø - resultater fra klassiske tvillingestudier

Type 2-diabetes er traditionelt blevet anset for at være en overvejende genetisk sygdom, hvilket i høj grad bygger på de tidligst rapporterede konkordansrater på mellem 50 og 92 hos MZ-tvillinger (Tabel 1). De fleste tvillingestudier har rapporteret om signifikant lavere konkordansrater for type 2-diabetes hos DZ-tvillinger, hvilket har bekræftet opfattelsen af en væsentlig genetisk komponent i ætiologien til type 2-diabetes. Selv i de mest selekterede studier har konkordansraten for type 2-diabetes hos MZ-tvillinger imidlertid været under 100%, hvilket bekræfter betydningen af en ikkegenetisk komponent i ætiologien til type 2-diabetes. Som anført i tabellen fandt vi i vores seneste populationsbaserede danske tvillingestudie ingen statistisk signifikant højere parvis konkordansrate for type 2-diabetes hos MZ-tvillinger (0,33) end hos DZ-tvillinger (0,23) (17). Studiet, som inkluderede i alt 606 tilfældigt udvalgte danske tvillinger, som alle fik udført en oral glukosetolerancetest (OGTT), stillede dermed spørgsmålstegn ved den gængse opfattelse af en overvejende genetisk ætiologi til type 2-diabetes. Resultaterne fra de orale glukosebelastninger gjorde os imidlertid i stand til at opgøre data ud fra kriteriet »abnorm glukosetolerance«, der inkluderede både patienter med manifest type 2-diabetes og nedsat glukosetolerance (IGT). Hermed fandtes en statistisk signifikant højere parvis konkordansrate for kriteriet abnorm glukosetolerance hos MZ-tvillinger (0,46) end hos DZ-tvillinger (0,28) (p<0,05). På baggrund af disse fund har vi foreslået, at genetiske faktorer overvejende spiller en rolle for udvikling af IGT, mens progressionen fra IGT til manifest type 2-diabetes overvejende skyldes miljøfaktorer. De beregnede probandvise konkordansrater for »abnorm glukosetolerance« var 0,50 for MZ-tvillinger og 0,37 for DZ-tvillinger (17).

Type 2-diabetes' patofysiologi

Ud over konkordansrater og heritabiliteter har studiet af specielt MZ-tvillinger, der er diskordante for type 2-diabetes, vist sig at være særdeles givtigt, når det drejer sig om studier af type 2-diabetes' ætiologi og patofysiologi. Det forhold, at adskillige studier har rapporteret om metaboliske abnormiteter hos non-diabetiske kotvillinger til MZ-tvillinger med type 2-diabetes inkl. forhøjede faste- og post-OGTT-plasmaglukosekoncentrationer (13, 15, 19-21), defekt insulinsekretion (13, 19) og insulinresistens (19), understøtter vores formodning om en genetisk komponent ved type 2-diabetes.

Adskillige studier af førstegradsslægtninge til patienter med type 2-diabetes har påvist perifer insulinresistens hos dem i modsætning til hos matchede personer uden familiær disposition for diabetes, hvilket har givet anledning til den udbredte opfattelse af, at insulinresistens er den væsentligste genetisk betingede patofysiologiske defekt ved type 2-diabetes (22). Imidlertid var det mest overbevisende fund tilstedeværelsen af defekt insulinsekretion i vores studie af non-diabetiske MZ-kotvillinger til tvillinger med type 2-diabetes, der blev sammenlignet med kontrolpersoner uden familiær disposition for type 2-diabetes (19).

Idet monozygote og dizygote tvillinger i varierende grad udsættes for forskellige prænatale påvirkninger, er der stillet spørgsmålstegn ved validiteten af ætiologiske konklusioner i studier baseret på den klassiske tvillingemodel, specielt hvad angår type 2-diabetes, insulinresistens, hypertension og kardiovaskulær sygdom.

Yderligere viste vores studier af diskordante MZ-tvillingepar, at både insulinsekretionsdefekten og insulinresistensen, der svarede til den perifere glukoseoptagelse, samt aktiveringen af enzymet glykogensyntase i skeletmuskulaturen har kvantitativt væsentlige ikkegenetiske komponenter (19, 22-23). Med hensyn til andre metaboliske defekter af betydning for udviklingen af hyperglykæmi ved type 2-diabetes viste vores studier af diskordante tvillingepar ingen evidens for en genetisk betinget øget hepatisk glukoseproduktion (19) eller genetisk betinget defekt tarminkretinhormonsekretion (GLPI og GIP) (20) ved type 2-diabetes. Derimod viste tilstedeværelsen af øget hepatisk glukoseproduktion og defekt GLP1-sekretion hos tvillinger med manifest type 2-diabetes, at disse metaboliske defekter i forbindelse med type 2-diabetes skyldes non-genetiske faktorer (19, 24).

Afslutningsvist har studier af muskelbiopsier, der er udtaget fra tvillinger, der er diskordante for type 2-diabetes, påvist, at abnormiteter i ekspressionen af en række mitokondrielle gener samt glykogensyntasegenet ved type 2-diabetes er betinget af non-genetiske faktorer (25, 26). I studier, der udføres i øjeblikket, benytter vi i samarbejde med en række internationale forskningsgrupper cDNA-microarray-teknikken appliceret på muskelvæv, der er udtaget fra diskordante MZ-tvillingepar med henblik på at identificere primære og sekundære ændringer i muskelgenekspressionen ved type 2-diabetes. Disse studier er endnu ikke afsluttet, men foreløbige opgørelser tyder på, at langt de fleste genekspressionsændringer ved type 2-diabetes er sekundære.

Tvillinger og insulinresistenssyndromet

Insulinresistenssyndromet inkluderer glukoseintolerance og type 2-diabetes, dyslipidæmi, hypertension, fedme og hyperinsulinæmi, som alle er tilstande, der er associeret til insulinresistens, og muligvis på baggrund af dette ofte optræder samtidig. Betydningen af dette syndrom har tildraget sig betydelig opmærksomhed igennem de seneste årtier, hvilket ikke mindst skyldes, at alle de elementer, der er inkluderet i syndromet, udgør væsentlige kardiovaskulære risikofaktorer. Vi har derfor i vores danske tvillingepopulation ønsket at undersøge forekomsten og ætiologien til de enkelte elementer, der er indeholdt i insulinresistenssyndromet (27). Sammenfattende fandt vi en statistisk signifikant betydning af arv for BMI, 120-minutterspostoralglukose (OGTT) plasmaglukosekoncentration, systolisk blodtryk (SBT), diastolisk blodtryk (DBT) og plasma HDL-kolesterolkoncentration, mens graden af abdominal fedme udtrykt ved talje-hofte-ratioen korrigeret for BMI, fasteplasmainsulin og fasteplasmatriglyceridkoncentrationerne ikke kunne påvises at have nogen genetisk komponent bedømt ved heriabilitetsestimater (Tabel 2). Vi fandt, at arveligheden for SBT var størst hos mænd, mens arveligheden for DBT var størst hos kvinder. Ved at korrelere de individuelle elementer indbyrdes fandt vi en relativ stærk sammenhæng mellem faktorerne BMI og fasteplasmainsulin, talje-hofte-ratio og plasmatriglycerid samt plasma-HDL-koncentrationer, mens korrelationerne mellem disse faktorer og henholdsvis SBT og DBT samt totimerspost-OGTT-plasmaglukosekoncentrationerne var relativt svage (Fig. 1) (27). På baggrund af dette fund konkluderede vi, at der indeholdt i insulinresistenssyndromet findes et kernekompleks, der inkluderer hyperinsulinæmi, fedme og dyslipidæmi.

Betydning af det intrauterine miljøfor glukosetolerance og insulinvirkning hos tvillinger

Fødselsvægtshypotesen, eller rettere the thrifty phenotype hypothesis, blev formuleret af Barker & Hales i slutningen af 1980'erne (28, 29). Hypotesen byggede på fundet af en sammenhæng mellem lav fødselsvægt og udviklingen af glukoseintolerance, hypertension og kardiovaskulær sygdom årtier senere i livet (28, 29). Sammenhængen mellem abnorm glukosetolerance og lav fødselsvægt blev senere bekræftet i en række forskellige studier inklusive et studie, der omfattede danske tvillinger (21). I den originale hypotese blev det foreslået, at en defekt pankreatisk insulinsekretion, der er betinget af et uhensigtsmæssigt intrauterint miljø, kunne prædisponere til senere udvikling af type 2-diabetes, såfremt man blev udsat for vestlig, passiv levevis og overvægt. Senere har en række studier imidlertid vist, at lav fødselsvægt hos mennesker snarere er associeret med insulinresistens end med en absolut defekt insulinsekretion (30). Det er blevet foreslået, at udviklingen af insulinresistens kan frembyde en overlevelsesmæssig fordel hos det underernærede foster, idet det sparsomme energitilbud kan omdirigeres til vitale væv såsom hjernen. I »bedre« perioder, der er karakteriseret ved et stort ernæringstilbud, vil energien som følge af samme metaboliske ændring kunne oplagres i det mere energikonserverende fedtvæv. Navnet the thrifty phenotype hypothesis er direkte inspireret af the thrifty genotype hypothesis som blev formuleret af Neel i 1962, idet han foreslog, at genetisk betinget hyperinsulinisme kunne repræsentere en genotype, som under visse ernæringsmæssigt dårlige omstændigheder kan være forbundet med en øget overlevelse, og under andre mere gunstige omstændigheder kan forårsage sygdom såsom type 2-diabetes.

Den sammenhæng mellem lav fødselsvægt og risikoen for type 2-diabetes, der er fundet i nogle studier, kunne teoretisk set også skyldes, at en genetisk betinget lav fødselsvægt samtidig kan disponere for diabetes årtier senere. Insulin vides at have betydning for intrauterin vækst, og det er sandsynligt, at en genetisk betinget defekt insulinsekretion eller insulinvirkning kunne være væksthæmmende. Vores fund af signifikant lavere fødselsvægte hos MZ-tvillinger med manifest type 2-diabetes end hos deres genetisk identiske ikkediabetiske kotvillinger støtter imidlertid ikke den opfattelse, at en genetisk betinget lav fødselsvægt alene forklarer sammenhængen mellem lav fødselsvægt og type 2-diabetes (Fig. 2) (21).

Ud fra vores viden om at MZ-og DZ-tvillinger udsættes for et forskelligt intrauterint miljø, hvor MZ-tvillinger teoretisk har større risiko for underernæring, sammenlignede vi OGTT-plasmaglukose- og insulinprofilerne mellem ældre MZ- og DZ-tvillinger (31). Vi fandt, at MZ- sammenlignet med DZ-tvillinger havde højere 30 minutters, men ikke 120 minutters, post-OGTT-plasmaglukose og insulinkoncentrationer (31). Fundet af forhøjet inkrementalt insulinareal under kurven hos MZ- sammenlignet med DZ-tvillinger støtter den antagelse, at det intrauterine miljø har betydning for udvikling af type 2-diabetes, og at sammenhængen medieres via insulinresistens. Dette fund støttes af et studie, hvori man rapporterede om en øget anden fase-insulinrespons efter intravenøs glukoseindgift hos ældre (62-årige) MZ- end hos DZ-tvillinger (32). Derimod fandt Baird et al samme plasmaglukose- og insulinkoncentrationer efter oral glukoseindtagelse hos 44-årige MZ- som hos DZ-tvillinger (33). Forklaringen på de divergerende resultater er sandsynligvis forskelle i alder mellem tvillingegrupperne. Vi har for nylig i et studie af yngre og ældre MZ- og DZ-tvillingepar studeret insulinvirkning ved hjælp af den euglykæmiske hyperinsulinæmiske clamp-teknik (personlig meddelelse). Vi kunne i dette studie klart påvise, at ældre MZ-tvillinger er mere insulinresistente end ældre DZ-tvillinger, hvorimod vi overraskende fandt, at yngre MZ-tvillinger, der var i starten af 30'erne, havde en let øget insulinfølsomhed i forhold til aldersmatchede DZ-tvillinger. Betydningen af denne aldersafhængighed er i skrivende stund uafklaret, men væsentligt er det, at den påviste aldersafhængighed støttes af dyreeksperimentelle studier, som viser en øget insulinfølsomhed hos tre måneder gamle rotteunger, som intrauterint har været udsat for proteinunderernæring.

Det forhold, at tvillingestudier også har vist sig at være anvendelige i molekylærbiologisk orienterede undersøgelser, der er relateret til insulinresistens og type 2-diabetes, som fx til at belyse sammenhænge mellem geno- og fænotype samt til muskel-genekspressionsstudier kan betyde, at tvillingestudier i fremtiden vil indtage en mere central plads i biomedicinsk forskning.

Thrifty-fænotype eller thrifty-genotype

Det er kendt, at DZ-tvillinger forekommer hyppigere i visse familier end i andre, hvilket peger på, at genetiske faktorer kunne være af betydning for forekomsten (og/eller overlevelsen) af DZ-tvillinger. For nylig rapporterede Busjahn et al om en øget forekomst af en genpolymorfi (ændring i bas