Angiogene proteiner: mulige markører for patofysiologiske processer under fosterudvikling

Angiogenese (karnydannelse) er essentiel under graviditeten. Processen reguleres af specifikke vækstfaktorer og receptorer, bl.a. vascular endothelial growth factor (VEGF), placenta growth factor og en cirkulerende VEGF-1-receptor. Disse proteiner er påvist bl.a. i maternelt serum/plasma. Graviditetsrelaterede patologiske tilstande (præeklampsi og vækstretardering) synes at være relaterede til abnorm ekspression af disse molekyler, og muligheden for at benytte dem som tidlige markører for udviklingen af graviditetskomplikationer er nærliggende. Imidlertid induceres angiogenese også af bl.a. inflammation og cancer. Validering af markørernes specificitet og sensitivitet nødvendiggør målinger af vækstfaktorer i forhold til gestationstidspunkt, evt. suppleret med målinger af andre endotelderiverede molekyler.

Angiogenese er en forudsætning for vækst og differentiering af væv og organer. Til stadighed remodelleres organismens kargebeter, både ved fysiologiske processer og som led i patologiske tilstande (Fig. 1 ). Angiogenese er en kompleks proces, der reguleres via pro- og antiangiogene molekyler. Processen er helt essentiel under graviditet, dels pga. fosterets stadige vækst, dels for at sikre en sufficient placentaudvikling. Denne oversigt vil fokusere på angiogenesen under graviditet, en specifikt reguleret, fysiologisk tilstand og på mulighederne for at benytte angiogene molekyler som markører for patologiske graviditetsrelaterede tilstande, såsom præeklampsi og vækstretardering, idet der er evidens for, at angiogen dysregulering og generel endotelaktivering spiller en rolle i patogenesen.

Oversigten er baseret på Pub Med-søgninger (søgeord: VEGF, PlGF, sVEGFR-1,angiogenesis, pregnancy, preeclampsia, IUGR, plasma, endothelium og placenta), og de udvalgte referencer repræsenterer dels status- og oversigtsartikler om vascular endothelial growth factor (VEGF)-proteiners roller i forbindelse med fosterudvikling, dels de relevante og velgennemførte studier, der belyser VEGF-proteiners potentiale som markører for graviditetsrelaterede patologiske tilstande. Alle referencer , som omhandler proteiner af VEGF-familien, er publiceret i årene 1996-2001. Der foreligger ingen Cochrane-reviews om emnet.

Angiogene molekyler, VEGF-familien

Angiogenese reguleres af adskillige molekyler, hvis indbyrdes samspil ikke er klarlagt i detaljer. De væsentligste angiogeneseinducere og -inhibitorer og de celletyper, der producerer dem, er gennemgået i tidligere arbejder [1]. I dette arbejde fokuserer vi på »VEGF-familien«: VEGF, VEGF-A, placenta growth factor (PlGF) og de specifikke receptorer VEGFR-1 og VEGFR-2, som synes at være blandt de mest udslagsgivende angiogene faktorer under graviditet.

VEGF-proteiner omfatter undertyperne VEGF-A, -B, -C, -D og PlGF, der findes i adskillige isoformer. Ekspressionen af de forskellige VEGF-former foregår i bl.a. granulocytter, megakaryocytter (trombocytter) og celler i glatte muskler. Under graviditet er trofoblasten den væsentligste producent af PlGF. En oversigt over VEGF-proteinernes kendte funktioner fremgår af Tabel 1 .

Forskellene mellem VEGF-formerne er bl.a. baseret på affiniteten for de specifikke VEGF-receptorer, hvoraf der kendes tre: VEGF-receptor 1 (VEGFR-1/flt-1), VEGFR-2 (KDR/flk-2), samt VEGFR-3 (flk-4), (Tabel 1) [2]. Receptorerne er transmembrane proteiner med et tilknyttet intracellulært tyrosin-kinase-domæne. Både VEGF-molekyler og -receptorer danner dimere komplekser under ligand/receptorinteraktionen, som resulterer i fosforylering af intracellulære receptordomæner, sekundær messenger -regulerede kaskadereaktioner og ændret gentranskription [2]. VEGFR-1, receptoren med den højeste affinitet for VEGF-A, findes også i en forkortet, solubel form, betegnet sVEGFR-1, som produceres ved posttran-skriptionel modifikation af mRNA for den membranbundne receptor. Den soluble receptor menes at regulere VEGF's biologiske aktivitet [3] dels ved at sekvestrere VEGF og dermed forhindre interaktion med membranbundne receptorer, dels ved at danne heterodimere receptorer med membranbundne receptorer, inkl. VEGFR-2, hvorved signaltransmissionen blokeres [4]. VEGF-receptorerne findes næsten udelukkende på endotelceller. Umodent endotel med sparsom rekruttering af pericytter og glatte muskelceller er afhængigt af VEGF, som via receptorerne medierer et antiapoptosesignal [1, 2]. Modent, hvilende endotel er stabilt og synes ikke at behøve et stadigt VEGF-stimulus.

Angiogenese under graviditet

Under fostervækst og placentaudvikling sker primært en uddifferentiering af angioblaster, der organiserer sig i strenge med efterfølgende lumendannelse. Denne proces kaldes vaskulogenese og er kritisk afhængig af VEGF og VEGFR-1 og -2. Forsøg på knockoutmus med inaktiverede gener for netop disse proteiner resulterede i manglende differentiering og organisering af angioblaster og resorption af fosteret efter 8-10 dage [2, 5]. De grundlæggende kargebeter i det humane foster dannes omkring tredje uge, hvorefter der sker et gradvist skift fra vaskulogenese til egentlig angiogenese - kapillærnydannelse ved knopskydning - som kendetegner selve organudviklingen. En optimalt fungerende placenta kræver tæt, koordineret udvikling af maternelle og føtale kargebeter. Det uteroplacentale kredsløb etableres fra omkring tolvtedagen, hvor den ekstravilløse trofoblast invaderer karvægge i endometriets spiralarterier og bevirker omdannelsen til uteroplacentale arterier med lav impedans. Den villøse trofoblast med primære solide villi, invaderes omkring tyvendedagen af mesodermale celler, der efterfølgende differentierer ud til blod- og endotelceller. Ultimativt dannes terminale villi med kar præget af længdevækst og loopdannelse, dvs. karrene prolaberer ud direkte under villus' overflade. Diffusionen mellem føtalt og maternelt kredsløb kan dermed ske over den få μm tynde vaskulosyncytielle membran. Udvekslingen mellem det maternelle og det embryonale kredsløb er endeligt etableret, når de villøse kapillærer opnår forbindelse med kapillærerne i chorionpladen og i den fremtidige navlestreng [6].

Reguleringen af angiogenese

Flere har undersøg t føtalt og placentalt væv (placentabiopsier og navlestrengsendotel) for ekspression af vækstfaktorer, receptorer eller cytokiner i håb om at belyse ukendte aspekter af angiogeneseprocessen og især patogenesen ved graviditetsrelaterede sygdomme. Ekspressionsstudier af humane placentae har dokumenteret tilstedeværelsen af adskillige angiogene vækstfaktorer og deres receptorer og givet detaljeret, men ikke entydig, viden om angiogenesereguleringen.

Resultaterne tyder på store svingninger i distributionen af VEGF, PlGF og receptorer i placenta gennem hele gestationsperioden, og i studierne konkluderes det generelt, at VEGF-relaterede proteiner spiller væsentlige roller i reguleringen af vækst og differentieringen af placenta både via parakrine og autokrine mekanismer. Reguleringen er både spatialt og temporalt reguleret via VEGFR-1, som især blev detekteret i første trimester, diffust i både villi og i den ekstravilløse trofoblast. VEGFR-2 kunne påvises i placentale endotelceller gennem hele gestationen, mens PlGF-proteinet især var lokalise-ret til den villøse trofoblast (syncytiotrofoblasten) i første og tredje trimester. VEGF-protein blev påvist i kirtelepitel og villøst stroma, moderat svingende gennem gestationsperioden [7, 8].

Et helt grundlæggende signal til angiogenese er lokal hy-poksi, som via hypoksiresponsive transkriptionsfaktorer, bl.a. hypoxia inducible factor 1 (HIF-1), regulerer ekspressionen af endotelspecifikke vækstfaktorer, herunder VEGF. Hypoksi bevirker desuden øget stabilisering af visse geners mRNA, hvilket resulterer i øgede mængder genprodukt [9].

I forbindelse med angiogenesen ved graviditet spiller hormoner, især østrogen og hCG, regulerende roller, bl.a. er genekspressionen af VEGF i uterus øget under graviditet [10], og østradiol i fysiologiske koncentrationer resulterer i signifikant øgede mængder VEGF og VEGFR-2 mRNA og nedsat ekspression af VEGFR-1 i endometriestroma [11]. Østrogener synes også at potentiere den vasodilatoriske effekt af VEGF, sandsynligvis via en øget NO-produktion [12]. Kardilatation øger som regel karpermeabiliteten, og ekstravaserende plasmaproteiner danner formentlig en ekstravaskulær matrix, der optimerer omstændighederne for karindvækst [13].

HCG inducerer ekspression af VEGF i endometriet [14] og både hCG og specifikke hCG-receptorer produceres af trofoblaster [15], bl.a. afhængigt af O2 -tilbuddet [16].

Præeklampsi og føtal væksthæmning

Morfologiske studier har vist, at præeklamptiske placentae er kendetegnet ved et ekstremt udbygget villøst kargebet, mens syncytiotrofoblastlaget er relativ tyndt. Omdannelsen af spiralarterier til uteroplacentale kar er inkomplet og medfører uteroplacental O2 -insufficiens [6]. Patologiske (intrauterin væksthæmning [IUGR]) placentae (defineret ved UL-Dopp-ler-påvist reduceret eller ophørt slutdiastolisk flow i aa. umbilicales) er derimod kendetegnet ved øget mitotisk aktivitet i den ekstravilløse trofoblast og kompromitteret kapillærvækst med forlængede, uforgrenede kar [17].

Den O2 -afhængige regulering af VEGF-, PlGF- og VEGF-receptorer, ikke mindst den soluble receptor sVEGFR-1, menes at være helt centrale for udviklingen af præeklampsi og IUGR. Placentavæv reagerer i gentagne studier på hypoksi med øget VEGF-ekspression, samtidig med at PlGF nedre- guleres [18, 19]. Effekten heraf svarer til de morfologiske fund på placentae fra gravide med præeklampsi, hvor den kompensatoriske VEGF-stigning må forventes at medføre en udtalt, men ineffektiv, vaskulær »knopskydning«. Analyser af IUGR-placentae har vist opregulering af PlGF og lave mængder VEGF. Resultaterne har ført til hypotesen om relativ placental hyperoksi ved IUGR, hvilket understøttes af, at der i blodet i de intervilløse rum i disse placentae er fundet høje O2 -niveauer [20].

De gestationelle svingninger i ekspressionen af VEGF-proteiner og receptorer i normale placentae tyder på, at VEGF via VEGFR-2 og VEGFR-1 medierer den tidligt forekommende (første trimester) forgrenede angiogenese, mens PlGF/ VEGFR-1 interaktionen resulterer i den senere kapillære længdevækst, der er nødvendig for dannelsen af terminale villi. Samtidig sker der en regulering på receptorniveau, idet den soluble sVEGFR-1, der primært produceres af trofoblasten, opreguleres af hypoksi og hæmmes af hyperoksi [20]. Da sVEGFR-1 hovedsagelig menes at fungere som VEGF- og PlGF antagonist ved at binde proteinerne uden at mediere nogen effekt, resulterer hypoksi i mere VEGF og flere receptorer, der primært hæmmer effekten af det allerede nedregulerede PlGF - alt i alt en øget VEGF-effekt som ved fundene hos gravide med præeklampsi. Tidlig hyperoksi, som ved IUGR, medfører derimod færre receptorer, mindre VEGF, men en væsentlig forstærket PlGF-effekt i placenta, resulterende i dårlig proliferation/øget apoptose af cytotrofoblasten, færre karforgreninger og høj impedans i det føtoplacentale kargebet, dvs. forringede muligheder for O2 -ekstraktion fra det maternelle blod.

Flere har undersøgt, hvordan den ekstravilløse trofoblast påvirkes af VEGF og PlGF mht. invasion og motilitet, men i in vitro-forsøg med trofoblaster kunne det ikke bekræftes, at ændrede vækstfaktor-niveauer allerede under den tidligste invasion af decidua resulterer i den overfladiske/insufficiente placentadannelse, der observeres ved præeklampsi eller IUGR [21].

VEGF, PlGF og sVEGFR-1 som markører for præeklampsi

VEGF, PlGF og soluble receptorkoncentrationer er ved hjælp af enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA)- og radio immuno assay (RIA) - metoder blevet målt i serum, plasma og amnionvæske, både under normale og komplicerede graviditeter. Skønt de fundne mængder - afhængig af testmetoder og prøvehåndtering - varierer væsentligt, er der efterhånden konsensus om, at abnorm vækstfaktorkoncentration i føtale og maternelle væv spiller en rolle, ikke blot for fostervæksten, men også for maternelle komplikationer (ødemdannelse, protein-uri og hypertension), der menes udløst af en systemisk endotelaktivering med accellereret cytokinproduktion, abnorm karreaktivitet og koagulation [22]. I flest studier har man undersøgt VEGF, målt i serum fra præeklamptiske patienter, altså tredjetrimester-målinger. Resultaterne har som regel været sammenholdt med en kontrolgruppe af raske gravide og evt. med et antal ikkegravide. Disse undersøgelser viste dels, at gravide typisk har forhøjede VEGF-værdier i forhold til ikke-gravide, dels at manifest præeklampi medfører yderligere, markante forhøjelser af VEGF-spejlet [23, 24]. Hvorvidt VEGF spiller en rolle i patogenesen og kan bruges som tidlig markør for præeklampsi er ikke muligt at afgøre ud fra disse undersøgelser.

Andre har indsamlet serum eller plasma fra gravide med nogenlunde faste intervaller, typisk én gang i hvert trimester. Undersøgelserne viste, at VEGF-spejlet stiger gradvist gennem første trimester og første del af andet trimester og når et plateau omkring uge 20 [25]. Tidlige (gennemsnitlig i uge 14) VEGF-målinger på 539 gravide, viste ikkesignifikante forskelle mellem de 16 kvinder, der senere fik præeklampsi og de øvrige [26]. Et casekontrolstudium med 48 gravide, hvoraf ti fik præeklampsi, viste en klar tendens i prøver fra uge 20 og signifikante VEGF-stigninger i prøverne fra uge 30, altså før kliniske tegn på præeklampsi. På dette grundlag konkluderedes, at VEGF har potentiale som sygdomsmarkør [27]. En endelig validering af markørens specificitet og sensitivitet i serum foreligger endnu ikke, men formentlig kan der hos dem, der senere får præeklampsi, detekteres stigninger i VEGF fra sidst i andet trimester.

Enkelte arbejd er har drejet sig om PlGF. Generelt er der fundet signifikant højere niveauer hos raske gravide end hos patienter med præeklampsi [28-30], hvilket umiddelbart stemmer overens med den nævnte O2 -hypotese. Et studie med serum fra 308 raske gravide med løbende prøver fra midt i første trimester til sidst i andet trimester viste en klar profil, med tiltagende PlGF efter uge 16 indtil uge 30 (højeste værdi), hvorefter værdierne faldt gradvist mod terminen. Der blev desuden målt PlGF hos 30 gravide med præeklampsi omkring 36. uge, og disse værdier blev sammenlignet med værdierne fra raske gravide med samme gestationstidspunkt. Man fandt signifikant lavere værdier ved præeklampsi, men ingen signifikante korrelationer mellem sværhedsgraden af præeklampsi, fødselsvægt og PlGF-værdier [31]. Målinger af total-PlGF hos 25 raske gravide og 14 gravide med præeklampsi i første, andet og tredje trimester viste, at gravide med præeklampsi allerede fra første trimester og igennem hele graviditeten havde signifikant lavere PlGF-niveauer som tegn på en tidligt udviklet placentahypoksi, hvilket tydede på, at lav PlGF var en ret specifik og tidligt optrædende markør for præeklampsi [32]. I et andet casekontrolstudium, hvor man har sammenlignet plasma-PlGF tidligt i graviditeten (uge 15) fra 22 kvinder inden udviklingen af præeklampsi-symptomer med 22 raske gravide, fandt man dog ikke, at PlGF var en klinisk anvendelig præeklampsimarkør, idet forhøjede værdier blev målt hos de gravide, der senere fik præeklampsi [33].

Den soluble VEGFR-1 er måske også en brugbar markør. Placenta secernerer receptor-proteinet, og detektion i plasma er mulig. Endnu foreligger der dog ingen publicerede studier. I et enkelt studium har man målt amnionvæskes indhold af sVEGFR-1 hos raske gravide (andet og tredje trimester) og hos gravide med præeklampsi (tredje trimester) ved hjælp af en nyudviklet ELISA. Man fandt relativt højere værdier hos raske gravide i andet trimester end i tredje trimester, mens receptormængderne hos gravide med præeklampsi var signi-fikant forhøjede i tredje trimester [34]. Igen stemmer resultaterne overens med O2 -hypotesen, og de forhøjede serum/ plasma-VEGF-værdier (total) hos gravide med præeklampsi er måske direkte relaterede til det øgede niveau af sVEGFR-1. I Tabel 2 opsummeres markørfundene.

Diskussion

Præeklampsi, IUGR og tilstande, der giver udtalte ødemer tidligt i graviditeten, er forsøgt relateret til VEGF-ekspressionen i relevante væv. De ofte modstridende resultater, der præsenteres i forbindelse med VEGF-målinger og VEGF-udløste effekter, kan oftest relateres til forskelle i analysemetoder, især mht. de benyttede ELISA'er, der enten måler total (receptorbundet + frit) eller kun frit VEGF, afhængigt af de antistoffer, der indgår i den pågældende undersøgelse. Den soluble VEGFR-1 receptor og evt. andre ukendte VEGF-bindende proteiner har således forvoldt væsentlige problemer med mangelfuld detektering af VEGF og reproducerbarhed. Også tolkningen af resultaterne er præget af usikkerhed, idet effekten af VEGF formentlig reduceres ved binding. Der er efterhånden enighed om, at VEGF totalt er øget i serum og plasma hos patienter med præeklampsi, mens den biologiske VEGF-effekt reelt er nedsat pga. receptorbinding. En eventuel umættet VEGF-bindingskapacitet i vævsvæsker eller blodfraktioner, sandsynligvis som følge af forhøjet eller dysreguleret produktion af serum-VEGFR-1, kan tænkes at påvirke lokale effekter af PlGF og VEGF og resultere i placentainsufficiens, der så igen udløser et maternelt systemisk respons via VEGF og andre mediatorer. Trombocytter spiller måske en rolle i denne generelle aktivering, idet VEGF frigives fra aktiverede trombocytter. Signifikant nedsatte trombocyttal er påvist hos gravide med præeklampsi [31, 35]. Potentialet for VEGF-,
sVEGFR1- og især PlGF-målinger som prognostiske markører skal stadig valideres i større prospektive undersøgelser. I forbindelse med graviditet er det problematisk, at markørkoncentrationerne svinger ganske meget inden for få uger, idet de afspejler den diskontinuerte foster- og placentaudvikling. Markørprøver skal således tages med stor tidsmæssig nøjagtighed og først ca. 20 uger henne i graviditeten for at have prognostisk værdi. Klarlæggelse af naturlige svingninger i vækstfaktor- og receptorniveauer, dels i forbindelse med graviditet, men også ved bl.a. inflammatoriske tilstande, er forudsætningen for vurdering af resultaterne. Endnu foreligger der ingen systematiske undersøgelser af, hvordan andre vækstabnormiteter, bl.a. IUGR, influerer på vækstfaktorniveauerne.

Perspektiver

Som regel er øgede niveauer af proangiogenesefaktorer mere sensitive markører end fald i inhiberende faktorer. Imidlertid er det muligt, at den komplekse regulering af angiogenesen under graviditet kan belyses bedre ved at inddrage angiogeneseinhibitorer. sVEGFR-1 spiller utvivlsomt en rolle, afspejlet ved den påviste stigning i serumniveauet hos patienter med præeklampsi, og det er måske snarere en forhøjet eller tidsmæssig uheldig placental receptorekspression, der udløser de patologiske tilstande. Abnorme udtryk af endotel- og trombocytderiverede faktorer og adhæsionsmolekyler [22] synes også at have en vis prædiktiv værdi mhp. tidlig diagnostik af præ-eklampsi. Målrettet forskning i nye, koagulationsrelaterede markører og terapier bør udføres/styrkes. Tidlig diagnostik af graviditetskomplikationer, der helt eller delvist bunder i an-giogen dysregulering, kan dels optimere behandlingen ved at komme »patologien i forkøbet«, dels belyse mere generelle aspekter ved angiogenese, bl.a. omkring den normale opretholdelse af ikkeaktiveret endotel. Tidligere intervention med optimeret, symptomatisk behandling er naturligvis en gevinst i sig selv, men såfremt abnorme vækstfaktorudtryk rationelt forklarer en sygdomsproces, er der håb om nye strategier mhp. at målrette fremtidige pro- og antiangiogenesebehandlinger.

Tina Marie Petersen, Gastroenheden, Kirurgisk Sektion,

afsnit 435, H:S Hvidovre Hospital, DK-2650 Hvidovre.
E-mail: tinampdk@yahoo.com

Antaget den 12. maj 2003.

H:S Hvidovre Hospital, Gastroenheden, Kirurgisk Sektion, og

Amtssygehuset i Herlev, Ultralydafdelingen.

Bent Ottesen takkes for konstruktiv kritik på et tidligt stadium i manuskriptskrivningen.