Anvendelse af molekylærbiologiske metoder ved invasiv prænatal genetisk diagnostik

Prænatale genetiske undersøgelser har været foretaget i mere end 30 år. I starten blev der fortrinsvis foretaget kromosomundersøgelser af celler fra fostervandsprøver og senere fra moderkageprøver samt biokemiske undersøgelser for visse medfødte stofskiftesygdomme og føtale misdannelser. I takt med at molekylærbiologiske teknikker blev udviklet og taget i anvendelse i den klinisk genetiske diagnostik i begyndelsen af 1990'erne, blev de også bragt i anvendelse i den prænatale genetiske diagnostik for at opnå en hurtigere og mere nøjagtig diagnostik og for at kunne udvide antallet af genetiske sygdomme, der kan undersøges for.

I Danmark foretages der ca. 7.000 invasive prænatale undersøgelser om året (1). Rutinemæssigt foretages der kromosomundersøgelse med båndfarvningsteknik på dyrkede celler, og svartiden er 1-2 uger for moderkageprøver og 2-3 uger for fostervandsprøver. Ud over risikoen for utilsigtet abort på grund af det invasive indgreb indebærer fosterkromosomundersøgelserne to væsentlige problemer. Det ene er fund af mere eller mindre komplicerede abnormiteter, hvis kliniske betydning er uvis. Det andet er den lange svartid, som i mange tilfælde er et stort problem for den gravide.

Med båndfarvningsteknikken kan de enkelte kromosomer identificeres, så numeriske kromosomabnormiteter, f.eks. Downs syndrom, kan diagnosticeres med stor sikkerhed. Grovere strukturelle abnormiteter, f.eks. større translokationer, kan også identificeres. Mindre strukturelle abnormiteter og tilstedeværelse af markerkromosomer (små strukturelt abnorme kromosomer af ukendt oprindelse) skaber imidlertid ofte diagnostiske problemer, som kun kan overkommes ved anvendelse af findiagnostik med molekylærbiologiske metoder, som har været benyttet i stigende omfang siden begyndelsen af 1990'erne (2).

I de senere år har man med fluorescens in situ-hybridisering (FISH)-teknik kunnet screene for de hyppigst forekommende numeriske kromosomafvigelser, der involverer kromosomerne 13, 18, 21, X og Y. Herved er den lange svartid på fostervandsprøver og moderkageprøver blevet reduceret til et par døgn. Metoden, som er et supplement til den konventionelle kromosomundersøgelse, er dog kostbar og benyttes kun i de tilfælde, hvor der er behov for et hurtigt svar (3).

Efterhånden som flere og flere sygdomsgener bliver identificeret, er det blevet muligt at foretage prænatal genetisk diagnostik for stadig flere monogene sygdomme. Der blev i 2000 foretaget 133 prænatale undersøgelser for 48 forskellige monogent nedarvede sygdomme. I midten (slutningen) af 1980'erne og i begyndelsen af 1990'erne var sekvensen kun kendt for ganske få gener, og de prænatale undersøgelser byggede på DNA-markør-undersøgelser, dvs. indirekte undersøgelse af et sygdomsgens nedarvning i en familie.

Molekylærbiologiske undersøgelser
for kromosomsygdomme
Findiagnostik af kromosomabnormiteter

I dag råder man over en række molekylærbiologiske metoder, som isoleret eller kombineret kan anvendes til at identificere selv meget små og komplicerede strukturelle kromosomabnormiteter. Metoderne er baseret på FISH, hvor en fluorokrommærket probe med en given DNA-sekvens hybridiseres til en komplementær DNA-sekvens på et kromosompræparat. Herved kan den pågældende DNA-sekvens identificeres på præparatet (2). I Tabel 1 gives en oversigt over de hyppigst benyttede FISH-metoder og deres væsentligste anvendelsesområder. Locusspecifikke prober kan benyttes til påvisning af kendte mikrodeletionssyndromer, f.eks. Prader-Willis og DiGeorges syndromer. Prober, som farver et enkelt kromosom (såkaldte maleprober), er velegnet til at påvise translokationer og markerkromosomer. Centromerprober benyttes til at identificere markerkromosomer. Subtelomerprober anvendes til påvisning af små subtelomere deletioner og translokationer. Ved multicolour -FISH, hvor proben består af alle 24 kromosomtyper hver med sin farve, kan man identificere ekstra kromosommateriale af ukendt oprindelse, f.eks. markerkromosomer. Komparativ genomisk hybridisering (CGH) er velegnet til identifikation af markerkromosomer og submikroskopiske deletioner og duplikationer, der ikke kan ses ved almindelig kromosomundersøgelse (4). Med de anførte metoder kan de fleste strukturelle abnormiteter identificeres prænatalt med stor sikkerhed. Fig. 1 viser konkrete eksempler herpå. Detaljer er beskrevet i figurteksten. I Fig. 1A benyttes en locusspecifik probe til at bekræftes diagnosen DiGeorges syndrom hos et foster, hvor UL-scanning har givet formodning herom. I Fig. 1B viser man ved en FISH-undersøgelse, at en gravid kvinde er bærer af en balanceret t(21q;22q), som ikke kan ses ved almindelig kromosomundersøgelse. Hendes første barn har en ganske lille ubalanceret t(21q;22q), som i forvejen er påvist ved en CGH-undersøgelse (ikke vist). Fig. 1C viser FISH-undersøgelse af en moderkageprøve fra den gravide translokationsbærer. Der er anvendt subtelomerprober for kromosom 21 og 22, som viser, at fosteret har en ubalanceret t(21q;22q). Dette bekræftes ved CGH-undersøgelse i Fig. 1D.

Hurtig diagnostik af numeriske kromosomabnormiteter

Fig. 1E viser hurtig diagnostik af trisomi 21, Downs syndrom, i udyrkede interfaseceller ved hjælp af locusspecifikke prober. For nylig er en billigere PCR-baseret teknik blevet introduceret som alternativ til FISH-teknikken. Den er baseret på højpolymorfe DNA-markører. De fleste mennesker har to forskellige alleler for disse markører. Har et menneske f.eks. to kromosomer nr. 21, vil kvantitativ fluorescens PCR (QF-PCR) vise to alleler med samme intensitet, repræsenteret ved et kromatogram med to toppe med samme højde. Er der tre kromosomer nr. 21, finder man tre alleler (toppe) af ens højde eller to toppe, hvor den ene er dobbelt så stor som den anden, hvis to af de tre kromosom 21 er identiske for den pågældende markør. Teknikken er taget i rutinemæssig anvendelse flere steder i udlandet og er under indkøring herhjemme (5). Det forventes, at metoden for en mindre merpris vil kunne tilbydes som supplement til den konventionelle kromosomundersøgelse for at opnå et hurtigt svar på de hyppigst forekommende kromosomabnormiteter.

Molekylærbiologiske undersøgelser
for monogene sygdomme

I de seneste år er generne for en lang række arvelige sygdomme klonet og karakteriseret. Dette medfører, at det teoretisk er muligt at identificere den sygdomsfremkaldende mutation i en given familie. I de tilfælde, hvor en bestemt sygdom skyldes få, hyppige mutationer (cystisk fibrose) eller samme type mutation (dystrophia myotonica), er prænatal diagnostik også næsten altid praktisk mulig, se eksempler i Fig. 1F og Fig. 1G. For en lang række sy gdomme gælder det imidlertid, at hver patient har sin egen private mutation i et givent gen. I disse tilfælde er det ikke altid praktisk muligt at identificere denne mutation, hvis genet er meget stort. Prænatal diagnostik kan i nogle af disse tilfælde udføres ved indirekte DNA-markør-analyse. Prænatal diagnostik af monogene sygdomme kræver altid, at familien er udredt i forvejen, dvs. at den kliniske diagnose og sygdomsgenet/mutationen er entydigt bekræftet. Prænatal diagnostik af disse sygdomme udføres næsten altid ved hjælp af CVS, og svar foreligger normalt i løbet af 1-3 dage. Risikoen for, at fostret er afficeret, er normalt mellem 25% og 50%, hvilket gør, at tidlig diagnose er meget vigtig.

Perspektiver: praktiske og videnskabelige

I løbet af de seneste år er metoderne til noninvasiv screening for føtalt Downs syndrom blevet forbedret væsentligt. Med den nuværende praksis, hvor invasiv diagnostik tilbydes til gravide, der er over 35 år, er detektionsraten for Downs syndrom kun 40%, hvorimod screening med en kombination af UL-markører og biokemiske markører ifølge beregninger giver en detektionsrate på over 90%. Man forventer derfor, at alderskriteriet snart bliver erstattet af noninvasive screeningsmetoder. Det betyder, at størstedelen af de screeningspositive gravide vil have en betydelig risiko for at vente et barn med Downs syndrom. Dette vil medføre krav om hurtig diagnostik, som vil kunne imødekommes ved anvendelse af QF-PCR som supplement til alle invasive prøver. For alle invasive prøver kan svartiden for de hyppigste kromosomfejl derfor snart forventes at blive reduceret fra 1-3 uger til 1-2 dage. Dette vil være et betydeligt fremskridt for den prænatale diagnostik. Ved indførelse af screening for Downs syndrom forventes et fald i antallet af invasive prøver, fordi falsk positiv-raten vil falde til en tredjedel eller måske en fjerdedel. Dette er også er et fremskridt, idet antallet af utilsigtede aborter, som skyldes den invasive prøve, derved vil falde. Hos et begrænset antal patienter vil der dog ved invasiv diagnostik fortsat påvises komplicerede strukturelle abnormiteter, som kun kan afklares ved molekylærbiologisk metodik. For disse patienter vil en sådan afklaring være af overordentlig stor betydning.

Sekvensen af menneskets genom er nu kendt, og udviklingen af f.eks. DNA-chips vil gøre det praktisk muligt at undersøge for så at sige alle sygdomsgener. I øjeblikket anvendes DNA-chips til påvisning af kendte mutationer, men metoden er under stadig udvikling. Selv om det bliver praktisk muligt at sekventere hele en persons genom, vil den store normalvariation, der findes i menneskets genom, imidlertid gøre det vanskeligt at skelne mellem normale varianter og sygdomsfremkaldende mutationer. Da en lang række genetiske sygdomme har samme kliniske fænotype, men skyldes mutation i forskellige gener, er et nært samarbejde mellem klinikere og molekylærgenetikere meget vigtigt. Genetisk rådgivning til og udredning af familier, hvor genetiske sygdomme forekommer, bør altid tilbydes før invasiv prænatal diagnostik igangsættes.

Claes Lundsteen , Klinisk Genetisk Afdeling 4052, H:S Rigshospitalet, DK-2100 København Ø. E-mail. lundsteen@rh.dk

Antaget den 16. januar 2003.

H:S Rigshospitalet, Juliane Marie Centret, Klinisk Genetisk Afdeling.