Bidrager montering af gastrointestinale biopsier på milliporefilter til en forbedret snitkvalitet?

Introduktion: Snitkvaliteten af gastrointestinale biopsier (GIB) har betydning for den diagnostiske sikkerhed af histopatologiske besvarelser. Et forhold af mulig betydning for den histopatologiske vurdering er orientering af vævet, således at skæring med større sikkerhed kan udføres vinkelret på mukosas overflade. For at opnå korrekt orientering, placeres GIB undertiden på milliporefilter (MF), hvor placering af resektionsflade på MF tilstræbes. Her analyseres værdien af MF-teknikken mhp. fremstilling af et acceptabelt snit af GIB.

Materiale og metode: Materialet omfattede tre konsekutive serier af GIB (60 prøver fra henholdsvis ventrikel, duodenum og kolorektum). Alle snit blev grupperet i MF-monteret versus ikke-MF-monteret materiale. Hver gruppe blev herefter inddelt i fuldt acceptable og ikke/mindre acceptable snit.

Resultater: 77,2% af alle GIB var MF-monterede. 33,1% af de MF-monterede mod 48,8% af de ikkemonterede snit klassificeredes som fuldt acceptable. Forskellene var ikke statistisk signifikante. 41,7% af de monterede GIB var fejlplaceret, således at mukosas overflade hvilede på MF med risiko for skader på vævet.

Konklusion: MF-montering af GIB bidrog ikke til bedre snitkvalitet. Da MF-teknikken blev oplevet som arbejdstung blandt patologiafdelingens bioanalytikere, kan denne metode ikke - set fra en patologs vinkel - tilrådes ved håndtering af GIB.

Snitkvaliteten af gastrointestinalt biopsi (GIB)-materiale har betydning for den diagnostiske sikkerhed og for detaljeringsgraden af den histopatologiske besvarelse. En række iatrogent betingede forhold influerer på kvaliteten. Varmepåvirkning ved biopsitagning kan kvæste vævet i en sådan grad, at præcis diagnostik ikke er mulig [1, 2]. Deformering kan opstå på grund af kompression af den luminale flade mod milliporefilter (MF) (se under resultater og diskussion) eller som følge af uhensigtsmæssig anbringelse af biopsi presset mod transportbeholderens sidevæg eller bund. Autolyse som følge af insufficient fiksering kan ligeledes forringe de diagnostiske muligheder.

Et andet forhold, der kan have betydning for den histopatologiske vurdering, er orientering af vævet. Dette er generelt en simpel opgave ved håndtering af store vævsstykker. Orientering af millimeterstore vævsstykker - som f.eks. GIB - er derimod vanskelig, og vil i fikseret stand stort set være umulig, idet vævet antager kugleform, hvorfor snittets plan i forhold til mukosas overflade/dybe resektionsflade kommer til at bero på tilfældigheder, medmindre særlige foranstaltninger iværksættes umiddelbart efter endoskopien med biopsitagning og forud for fiksering. Ofte vil snit af ventrikel og tarm fremstille brudte krypter (Figur 1 ) som udtryk for tangentiel skæring. Generelt finder vi et sådant snit fuldt acceptabelt, når blot samtlige mukosas lag er fremstillet. Når netop denne parameter fremhæves, skyldes det bl.a., at korrelation mellem morfologien af den superficielle og dybe del af mukosa kan rumme væsentlig diagnostisk information. I tilfælde, hvor kun nogle af mukosas niveauer er fremstillet, er det oftest de superficielle områder, der er fremstillet. Løsning af visse problemstillinger kræver imidlertid visualisering af mukosas dybeste dele.

Selv om tangentiel skæring generelt resulterer i et fuldt acceptabelt snit, tilstræbes naturligvis det optimale. Et sådant snit fremstiller mukosas overfladeepitel samt ubrudte kirtelrør (Figur 1) og lamina muscularis mucosa [3], hvilket - ud over en vis størrelse af GIB med inddragelse af dybeste del af mukosa - bl.a. forudsætter, at skæringen er udført vinkelret på overfladen [3]. Denne kan imidlertid være vanskelig eller umulig at identificere på en få millimeter stor fikseret biopsi. Placering af biopsier på MF umiddelbart efter biopsitagning er derfor tidligere foreslået [4] og anvendes som rutineprocedure i nogle endoskopiklinikker.

Nærværende undersøgelses overordnede formål er at vurdere, om brugen af MF sikrer en korrekt orientering af vævet og på denne måde bidrager til en forbedret snitkvalitet af GIB og følgelig til forbedrede muligheder for en præcis diagnostik.

Materiale og metoder

Undersøgelsen blev udført på konsekutive serier af GIB, der var udtrukket fra patologisystemets database, Patologiafdelingen, Hvidovre hospital, inden for tremåneders perioden 01.01.2003-31.03.2003 fra henholdsvis ventrikel, duodenum og kolorektum, idet vi inkluderede årets første 60 prøver fra hver lokalisation. En prøve svarer til en paraffinblok. Materialet hidrører således fra afdelinger på Hvidovre og Amager Hospital samt fra privatpraktiserende læger, der har sendt materiale til Patologiafdelingen på Hvidovre hospital.

GIB, der er monteret på MF, håndteres i Patologiafdelingens laboratorium på følgende måde: MF trimmes med skalpel, således at MF's kanter flugter med biopsierne. Hvis der foreligger > to biopsier på et MF og er disse ikke placeret på linje (Figur 2 ), bliver MF i relation til hver biopsi trimmet separat. Efterfølgende indstøbning udføres således, at skæringen om muligt orienteres vinkelret på MF's overflade.

Biopsierne blev på basis af gennemgangen placeret i en af følgende grupper:

1. Optimalt/fuldt acceptabelt snit (kirtelrør er ubrudte eller kirtelrør er brudte, men alle mukosas lag er fremstillet; i tilfælde af MF-montering hviler biopsiens profunde resektionsflade på MF (Figur 3A )).

2. Mindre/ikke acceptabelt snit:

3. Kirtelrør er brudte, og ikke alle mukosas lag er fremstillet.

4. Vævet er monteret med den luminale flade mod MF, der medfører en kompressionsbetinget deformering. Selv om orienteringen kan være korrekt, er et sådant snit uacceptabelt (Figur 3B).

5. Anden ikketilsigtet relation mellem væv og MF, hvor MF er displaceret eller foldet under skæringen, således at dele af vævet er »skjult« u nder MF.

I mange tilfælde omfattede de enkelte præparatglas snit af mere end en biopsi (op til fem biopsier), og i nogle tilfælde var der fremstillet trinsnit. Såfremt blot et af de MF-monterede/ikke monterede snit på præparatglassene fandtes optimalt/fuldt acceptabelt, grupperedes præparatet under a).

Statistik

Data blev analyseret ved brug af Fishers eksakte test. En p-værdi på < 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Samtlige 60 duodenalbiopsier var MF-monterede, 61,7% af ventrikelbiopsierne og 70% af kolorektalbiopsierne var monterede. Fordelingen af GIB i relation til vurderingen af snitkvalitet, biopsisted og +/- montering af GIB fremgår af Figur 4 . For biopsier, der var lejret på MF, blev der opnået et fuldt acceptabelt snit (svarende til gruppe a) i 43,2% af ventrikelbiopsierne, 31,7% af duodenalbiopsierne og 26,2% af kolorektalbiopsierne. Til sammenligning blev der blandt de ikkemonterede præparater opnået et fuldt acceptabelt snit (gruppe a) i 47,8% af ventrikelbiopsierne og i 50% af kolorektalbiopsierne. Mens andelen af optimale snit var størst for de ikkemonterede GIB, var forskellene ikke statistisk signifikante, hverken for materialet som helhed, for ventrikelbiopsierne eller for kolorektalbiopsierne.

I 41,7% af de MF-monterede GIB (37,8%, 48,3% og 35,7% af henholdsvis ventrikel-, duodenal- og kolorektalbiopsierne) var MF placeret klods på mukosas overflade (svarende til gruppe b2), hvilket medførte varierende grader af deformering af de mest superficielle dele af mukosa. I andre tilfælde svarede MF-vævs-relationen til gruppe b3.

Diskussion
Rationalet bag bestræbelser på orientering af gastrointestinale biopsier

En række forhold har betydning for kvaliteten af de snit, der fremstilles og dermed for tolkning af de enkelte histopatologiske observationer og for den endelige histologiske diagnose. En af de faktorer, der kan spille en rolle i diagnostikken, er orientering af vævet.

Langt de fleste problemstillinger, der kan blive aktuelle ved mikroskopi af GIB, løses bedst, når snittet fremstiller mukosas overfladeepitel samt ubrudte - dvs. længdeskårne - kirtelrør. Dette er et resultat af skæring, der er udført vinkelret på overfladen, hvilket generelt betragtes som en forudsætning for et optimalt snit. Vurdering af snit, der afviger fra det optimale, kan teoretisk føre til fejltolkninger. Således kan en normal mukosa ved tangentiel skæring fremtræde fortykket og hyperplasilignende, i andre tilfælde kan tangentiel skæring medføre et atrofilignende billede på grund af en øget afstand mellem krypter og muscularis mucosa [3]. Opmærksomheden på optimal orientering og skæring er således ofte skærpet ved mistanke om hyperplasi eller atrofi [5]. Det kollagene bånd under overfladeepitelet vil fremtræde tykt - undertiden > 10 μm - i tangentielt skårne områder, simulerende kollagen colitis og duodenums villi vil synes afkortede med en reduceret villus-krypt-ratio, som det ses ved cøliaki. Den lidt erfarne patolog vil dog sjældent drage sådanne fejlslutninger. Selv om skæring vinkelret på overfladen bør tilstræbes, betragter vi således ikke dette som et absolut krav. I overensstemmelse hermed har andre observatører nyligt konkluderet, at specielle tiltag mhp. orientering af GIB ikke er nødvendig i rutinediagnostikken [6]. Andre autoriteter inden for den gastrointestinale patologi støtter heller ikke den rutinemæssige brug af montering [7-9] bl.a. med den begrundelse, at når flere biopsier foreligger med fremstilling af snit fra flere niveauer, er chancen for, at mindst en af disse er korrekt orienteret, stor - som illustreret i Figur 1. Det er således sandsynligt, at andelen af acceptable, ikke-MF-monterede GIB, der ofte antager kugleform, øges ved trinskæring, hvorved man potentielt kan »nå ind til kuglens kerne«, der omfatter den dybeste del af biopsien. Derimod kan en konvertering af ikkeacceptable til acceptable MF-monterede GIB ved trinskæring ikke forventes. Det bør dog tilføjes, at betydningen af korrekt orientering især af duodenal/tyndtarmsbiopsier har været fremhævet af nogle [10], men ikke alle forfattere [6, 8], og fokus på håndtering af netop disse biopsier foreligger [10-14]. Det kan derfor ikke undre, at netop duodenalbiopsierne konstant var monterede i det aktuelle materiale, og selv om dette materiale således ikke tillod korrelation mellem snitkvalitet af MF- og ikke-MF-monterede duodenalbiopsier, kan vi konkludere, at med kun knap 1/3 fuldt acceptable snit har MF-teknikken næppe bidraget til snitkvaliteten af GIB fra denne del af tarmen.

Tiltag med henblik på korrekt orientering af vævet - med fokus på udbyttet af milliporefilter-teknikken

Chancen for fremstilling af det optimale snit øges betydeligt, såfremt mukosas overflade og resektionsflade kan identificeres ved paraffinindstøbningen. I bestræbelse på at sikre dette, er forskellige tiltag foreslået. Indlejring af højst en biopsi i hver paraffinblok vil - alt andet lige - øge chancen for en optimal orientering [15]. Denne løsning er imidlertid tidskrævende og kostbar. I nogle studier varetages orienteringen af en erfaren patologassistent, som er til stede i endoskopirummet [16]. Denne løsning er imidlertid ligeledes resursekrævende, men kan anbefales ved forskningsrelaterede opgaver, der bl.a. kan indebære morfometriske analyser på det histologiske snit [17]. Derimod er et sådant tiltag vanskeligt at gennemføre i rutinediagnostikken. Det samme gælder brug af stereomikroskop til orientering af vævet. En alternativ metode til sikring af korrekt orientering af biopsimaterialet er placering af det ufikserede væv på et substrat, f.eks. MF, således at den dybe resektionsflade hviler på dette, som tidligere anbefalet for biopsier fra ventrikel, bronkier og hud [4]. Den tidligere beskrevne agglutinering af vævets resektionsflade til MF [4] viste sig dog langt fra konstant i den aktuelle undersøgelse. Det er endvidere værd at bemærke, at omtalte metode undertiden suppleredes med orientering af biopsien under lup inden dets placering på MF [4].

Ud over det ovennævnte studie [4] foreligger yderligere tre arbejder [12, 14, 18] om MF-monterede duodenal- og ventrikelbiopsier, i hvilke der rapporteres gode resultater. Det danske arbejde var baseret på en meget bred erfaring med > 7.000 MF-monterede ventrikelbiopsier [4]. Mens nærværende analyse var baseret på et retrospektivt materiale, ville et prospektivt studie, i hvilket man korrelerede kvaliteten af MF-monterede versus ikkemonterede biopsier, der blev håndteret af særligt engagerede aktører, bedre kunne belyse dette emne, men et sådant design vil vanskeligt kunne indpasses i en travl rutinediagnostik. Der foreligger ikke tidligere publicerede analyser, der vurderer resultatet af MF-monterede kolorektalbiopsier. Det er heller ikke undersøgt, hvorvidt nogle endoskopører er bedre til at orientere og montere biopsierne end andre, men det kan ikke udelukkes, at personrelaterede forhold spiller en vis rolle, som tidligere antydet [9]. Selv om kravene for fuldt acceptable snit i dette arbejde var beskedne, var succesraten lavere - dog ikke statistisk signifikant - for MF-monterede snit end for ikkemonterede snit.

Iatrogene skader på vævet induceret af fejlplaceret milliporefilter

Mens holdningerne til den foretrukne håndtering af GIB er delte, hersker der imidlertid enighed om, at der bør udvises omhu ved håndtering af vævet, ikke mindst når dette monteres på et substrat [19]. Det samme gælder i øvrigt en hurtig, sufficient fiksering [9].

Nærværende biopsimateriale er primært håndteret af endoskoperende læge eller sygeplejerske, som ofte placerer vævet på MF. Korrekt brug af teknikken, der indebærer, at GIB's dybe resektionsflade placeres på MF, sikrer optimal orientering af vævet ved indstøbningen. Selv om korrekt orientering ligeledes opnås, når mukosas overflade hviler på MF, er en sådan lejring uhensigtsmæssig, idet risikoen for at iatrogene forandringer hermed forringer snitkvaliteten øges, og det undertiden i en sådan grad, at visse detaljer ikke kan vurderes. En sådan relation mellem væv og MF registreredes i godt en tredjedel af ventrikel- og kolorektalbiopsierne og i knap halvdelen af duodenalbiopsierne. I denne situation kan histologiske detaljer af den mest superficielle del af det biopterede materiale være sløret. Dels kan vævets overfladestruktur være ændret, dels kan cytologiske detaljer af de mest superficielt lokaliserede dele af det biopterede materiale være kamufleret. I overensstemmelse med vore erfaringer er skader på overfladeepitelet i forbindelse med håndtering/orientering af væv - inklusive brug af substratmetoden - bl.a. som følge af tryk på overfladen, beskrevet af andre observatører [9, 20].

Håndtering af biopsier på endoskopistuen og i patologilaboratoriet

Brug af MF faciliterer overførsel af GIB fra biopsitang til den tomme transportbeholder, der efterfølgende påfyldes med formalin. Anbringelse af GIB direkte i en formalinfyldt beholder er derimod ikke en farbar fremgangsmåde grundet miljømæssige hensyn. Mens dette forhold støtter brugen af MF, finder bioanalytikerne, at håndtering af MF-monterede biopsier er arbejdstung og tidskrævende. Udvikling af nye teknikker til overførsel af væv fra biopsitang til transportbeholder ville være ønskelig.

Konklusion

MF-teknikken bidrager ikke til en forbedret snitkvalitet. Snarere bliver denne undertiden forringet som følge af lædering af mukosas mest superficielle dele, hvilket kan forringe patologens diagnostiske muligheder. Medmindre et acceptabelt resultat opnås i en langt større andel af de MF-monterede GIB, kan denne teknik ikke tilrådes set fra en patologs vinkel.

Susanne Holck, Patologiafdelingen, Hvidovre Hospital, DK-2650 Hvidovre. E-mail: susanne.holck@hvh.regionh.dk

Antaget: 29. januar 2009

Interessekonflikter: Ingen