De toksiner, der er mest aktuelle i forbindelse med biologisk terrorisme, er ricin og toksinerne fra Clostridium botulinum . Dette skyldes deres ekstreme, akutte giftighed, deres relativt lette tilgængelighed og de aktuelle og historiske eksempler på deres anvendelse. Der gives her en oversigt over de to grupper af toksiner, deres forekomst, forgiftningernes symptomatologi og de diagnostiske muligheder med specielt fokus på miljøprøver. Illustration af anvendelsen af de forskellige diagnostiske metoder gives i forbindelse med to situationer, hvor der var mistanke om tilstedeværelse af toksin i henholdsvis fødevarer (gærede sælluffer) og en pulverprøve.
Ricin og toksinerne fra Clostridium botulinum er blandt verdens mest potente gifte [1]. Letal dosis (LD50 ) ved parenteral indgift hos mus af botulinumtoksin er ca. 1 ng/kg [1], hvorfor 0,1 μ g er en potentielt dødelig dosis for en voksen person. Ricin, toksinet fra ricinus communis (kristpalme), er ca. 1.000 gange mindre giftigt med en anslået LD50 på 0,1-1,0 μ g/kg afhængigt af administrationsmåden [2].
Centers for Disease Control and Prevention (CDC) har placeret botulinumtoksiner i kategori A, dvs. de farligste bioterrormidler. Botulinumtoksin til våbenbrug blev fundet i Irak og er blevet forsøgt udviklet i Japan [3]. Toksinerne er neurotoksiske og rammer den neuromuskulære transmission. Resultatet, paralyse og død, skyldes lammelser af respirationsmuskulaturen i et klinisk syndrom benævnt botulisme (pølseforgiftning, botulus betyder pølse). Ricin er placeret i CDC's kategori B og har flere gange været anvendt til mord og mordforsøg [3], ligesom der i England og Frankrig er optrevlet terrorceller, der bl.a. oprensede ricin. Det kliniske billede ved ricinforgiftning er i modsætning til botulismeforgiftning ukarakteristisk og præget af organsvigt. Symptomerne kan være blodig diare og opkast, letargi og respirationsbesvær. Aerosoludsættelse er mindst lige så dødelig som systemisk indgift. Histologisk ses der organskade som følge af multiple fokale blødninger.
I beredskabet mod bioterrorisme har udvikling af botulinumtoksin- og ricintoksin-assays høj prioritet, og Statens Serum Institut (SSI) har derfor udviklet immun-assays for botulinumtoksin type A-F til supplement til de sædvanlige musebaserede bio-assays bl.a. for at sikre simple og hurtige undersøgelser. SSI har ligeledes udviklet såvel immunkemiske som massespektrometriske metoder til påvisning af ricin. Vi vil her illustrere eksempler på disse metoders anvendelse.
Toksinanalyser ved kliniske tilfælde og i pulverprøver
Botulismetilfælde
Forgiftning med botulinumtoksin er under normale forhold meget usædvanlig. Af de syv botulinumtoksintyper A-G er A, B, E og i sjældne tilfælde type F årsag til forgiftninger hos mennesket [4]. Sporadiske tilfælde opstår typisk i forbindelse med indtagelse af jordbakterieforurenede fødevarer, som har kunnet inkubere under anaerobe forhold, specielt marine produkter og grøntsager [5]. I Danmark kan mange tilfælde af botulisme relateres til fødeemner, der er blevet behandlet på traditionel grønlandsk vis. Identifikationen af toksinet i sin rene form - dvs. uden tilstedeværende Clostridii -bakterier - kan ikke ske med DNA-baserede metoder, men fordrer et bio-assay med neutraliserende antistoffer eller immun- og proteinkemiske assays . De udviklede immun-assays har i øjeblikket den nødvendige specificitet, men kræver videreudvikling for at opnå detektionsgrænser, hvor f.eks. fødevarer eller væsker, der er under mistanke for at være tilsat botulinumtoksin, med sikkerhed kan erklæres for ufarlige.
Sygehistorie
En 60-årig grønlandsk kvinde, der tidligere havde været indlagt for botulisme, havde nu atter symptomer derpå efter indtagelse af hengemt (fermenteret) sælkød. En del af det tiloversblevne sælkød blev sendt til SSI, hvor der blev dyrket Clostridium botulinum . Polymerasekædereaktion udført på det tilsendte kød og på den isolerede bakterie viste begge tilstedeværelse af genet for botulinumtoksin, type E (Figur 1 A). Biologiske undersøgelser (injektion i mus med og uden tilsætning af neutraliserende antistoffer, udført på Danmarks Fødevareforskning) og protein- og immunkemiske analyser (Figur 1B) viste høje koncentrationer af botulinumtoksin, type E i ekstrakt fra kødet. I bio-assayet døde begge mus af 1:20.000 fortyndet ekstrakt, og anti-E-antiserum neutraliserede specifikt effekten.
Ricinmistænkelig bioterrorprøve
Bioterrormistænkelige prøver med ukendt indhold og uden erkendte relaterede kliniske tilfælde analyseres efter en fast strategi for bedst muligt at udelukke tilstedeværelse af patogene mikroorganismer i prøvematerialet, før toksinundersøgelserne udføres. De immunkemiske ricintoksin-assays , der er udviklet på SSI, har en detektionsgrænse på ca. 50 ng/ml. Assayet er under videreoptimering, men blev bl.a. i sin nuværende form anvendt på indholdet af et pulverbrev, der blev fremsendt med en trusselsnote til den amerikanske ambassade i København. Disse undersøgelser var inkonklusive (ikke vist). Pulveret blev derfor videreanalyseret ved hjælp af detergent (SDS)-polyakrylamid gelelektroforese. Ved denne undersøgelse blev der fundet et distinkt bånd, dvs. en proteinkomponent med en molekylvægt på ca. 64.000 (Figur 2 ). Da intakt ricin har en tilsvarende molekylvægt, var det nødvendigt at forsøge identifikation af indholdsstoffet i pulveret med massespektrometriske metoder. Båndet blev skåret ud af gelen, og proteinet blev nedbrudt til fragmenter ved trypsinbehandling, der spalter efter specifikke aminosyrerester i polypeptidkæder. Efterfølgende måling af fragmenterne blev ved hjælp af massespektrometri udført med en nøjagtighed, der muliggør identifikation af ukendte proteiner ud fra deres massefingeraftryk (Figur 2). Dis se analyser viste entydigt, at det udskårne bånd ikke indeholdt ricin, men derimod bovint serumalbumin (BSA). BSA har en molekylvægt på ca. 64.000 og imiterer således ricin ved størrelsesafhængig gelelektroforese, men er i modsætning til ricin et ufarligt og hyppigt anvendt stof i biokemiske laboratorier.
Diskussion
Baseret på faktiske hændelser [3], stoffernes tilgængelighed og deres akutte toksicitet er ricin- og botulinumtoksinerne blandt de mest aktuelle toksintrusler i bioterrorsammenhæng. Både mht. klinik, behandling og diagnostiske muligheder adskiller de to grupper af toksiner sig meget. Botulisme har i klassiske tilfælde en ret karakteristisk klinik, kan forsøges behandlet med antitoksin og diagnosticeres bl.a. ved hjælp af et bio-assay , der er baseret på anvendelse af forsøgsdyr og typespecifikke antisera. Hurtigdiagnostik kan nu foretages med immunkemiske og massespektrometriske metoder.
Ricinforgiftning har derimod en ukarakteristisk klinik. Der er ingen specifik behandling og intet bio-assay , men med udviklingen af ricinspecifikke immunreagenser er der udviklet immun-assay s. Ricinpåvisning i miljøprøver er særlig relevant, fordi ricin ikke umiddelbart kan påvises i kliniske prøver.
De massespektrometriske metoders store fordel er, at de er uafhængige af antagelser om arten af en ukendt prøve og uafhængige af tilstedeværelsen af specifikke epitoper, som kan være nødvendige for et givet antistofs binding, og som kan være fjernet f.eks. i gensplejsede toksiner.
Niels Henrik H. Heegaard , Autoimmunafdelingen, Statens Serum Institut, DK-2300 København S. E-mail: nhe@ssi.dk
Antaget: 18. februar 2005
Interessekonflikter: Ingen angivet
Taksigelser: Tak til Kristian Møller og Anna S. Schmidt , Danmarks Fødevareforskning for uvurderlig hjælp til validering af botulinumantistoffer.
Artiklen bygger på en større gennemgang. En fuldstændig litteraturliste kan fås ved henvendelse til forfatterne.
Summary Botulinum and ricin toxins. Ugeskr Læger 2005;167:3387-3389. Due to their acute toxicity, accessibility and history of use, ricin and botulinum toxins are at the present time the most relevant bioterror toxins. We give a brief review of their toxicity and possible uses in bioterror attacks and describe two cases in Denmark in which immunochemical, PCR and mass spectrometric assays developed in-house were used to confirm a foodborne botulinum toxin E case and to identify bovine serum albumin as the powder enclosed in a letter sent to the U.S. Embassy in Copenhagen.
