Flowcytometrisk diagnostik af hereditær sfærocytose

Introduktion: Hereditær sfærocytose (HS) diagnosticeres ved klinik, biokemi med hæmolyseaktivitet, forhøjet middelcellehæmoglobinkoncentration (MCHC) og nedsat osmotisk resistens. Sygdommen skyldes defekter i erytrocyttens cytoskelet. Eosin-5'-maleimid (EMA) er et farvestof, der binder til bånd 3 i erytrocytmembranen. Ved flowcytometrisk analyse af fluorescensintensiteten af EMA-mærkede erytrocytter findes nedsat fluorescensintensitet hos patienter med HS. Metoden er evalueret ved sammenligning af erytrocytfluorescensen ved henholdsvis HS og andre hæmolyser.

Materiale og metoder: Vi inkluderede 21 patienter med HS og 27 patienter med andre hæmolytiske tilstande. Erytrocytterne blev ved inkubation mærket med EMA, og ved efterfølgende flowcytometri blev middel-fluorescensintensiteten bestemt og resultatet udtrykt som EMA-procenten.

Resultater: Ud fra de opnåede resultater blev der fastsat en tærskelværdi for EMA-procenten på 15, hvilket er foreneligt med HS med en sensitivitet på 95% og en specificitet på 93%.

Konklusion: Den osmotiske resistensundersøgelse er ressourcekrævende og har lav specificitet og sensitivitet. Flowcytometrisk diagnostik med kvantitering af fluorescensen af EMA-mærkede erytrocytter er en hurtig og brugervenlig metode, der kan udføres i ethvert laboratorium med et flowcytometer. Vi har fundet, at metoden har høj sensitivitet og specificitet og kan anbefales til diagnostik af HS.

Hereditær sfærocytose (HS) er den hyppigst forekommende arvelige hæmolytiske anæmi i Nordeuropa. Sygdommen skyldes en defekt i et eller flere af de proteiner, der indgår i erytrocyttens cytoskelet. De mest almindelige proteindefekter hidrører spektrin, ankyrin, bånd 3 eller protein 4.2, hvoraf de to førstnævnte er de hyppigste, oftest som kombineret defekt [1]. Defekter i cytoskelettets proteiner medfører en dårlig forankring af cellemembranen. Det kliniske billede er relateret til hæmolyseaktiviteten med varierende grader af anæmi, icterus, galdesten og splenomegali, og fænotypen varierer fra meget mild sygdom til svær tranfusionskrævende hæmolyse. I de fleste tilfælde arves tilstanden dominant, men recessive tilfælde ses. Biokemisk ses en Coombs-negativ hæmolytisk anæmi med karakteristisk forhøjet middelcellehæmoglobinkoncentration (MCHC) og i perifert blodudstryg findes mikrosfærocytter, som dannes grundet tab af membranmateriale. Diagnosen HS stilles dog først og fremmest ved påvisning af erytrocytternes nedsatte osmotiske resistens, som er en manuel, tidskrævende undersøgelse med begrænset specificitet og sensitivitet [2]. Desuden kræves en vis laboratoriemæssig rutine for at sikre validiteten af undersøgelsen. Alternative undersøgelser som ektacytometerundersøgelse og sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) har høj sensitivitet, men er kun tilgængelige få steder [2, 3]. Nyere undersøgelser peger på, at man ved flowcytometrisk undersøgelse ved eosin-5'-maleimid (EMA)-binding til bånd 3 i erytrocytmembranen kan påvise HS med både høj sensitivitet og specificitet [4-7]. Vi har evalueret den flowcytometriske metode ved at sammenligne fluorescensintensiteten hos patienter med kendt HS og patienter med andre hæmolytiske tilstande.

Materiale og metoder

Over en etårig periode blev der indsamlet blodprøver fra 21 patienter med kendt HS (medianalder 28 år, spændvidde 2-75 år), der var diagnosticeret ved karakteristisk klinik, forekomst af hæmolytisk anæmi med forhøjet MCHC og nedsat osmotisk resistensundersøgelse. Flere patienter var genetisk disponerede for sygdommen. Fire patienter var splenektomerede. I undersøgelsen indgik desuden 27 patienter med andre typer af hæmolytisk anæmi (medianalder 50 år, spændvidde 7-84 år) herunder autoimmun hæmolytisk anæmi (n = 9), talassæmi (n = 2), seglcelleanæmi (n = 7), paroksysmal nocturn hæmoglobinuri (n = 4), hereditær elliptocytose (n = 3) og uklassificeret hæmolyse (n = 2). Blodprøverne blev opsamlet i ethylen-diamin-tetra-acetat (EDTA)-glas og sendt til afdelingens laboratorium.

Metodebeskrivelse

Erytrocytterne vaskedes to gange med 0,9% NaCl. Cellepellet blev talt og herfra udtoges 5 × 106 erytrocytter. Erytrocytterne inkuberedes med 25 mikroliter friskoptøet eosin-5'-maleimid (0,5 mg/ml) i Eppendorf-rør (1,5 ml). Inkubationstid en time i mørke ved stuetemperatur. Blandingen omrørtes et par gange i perioden. Efter inkubation centrifugeredes prøverne i mikrocentrifuge ved 10.000 × g i 10 sek. Supernatanten afpipetteredes forsigtigt og kasseredes. Cellepellet resuspenderedes i 500 mikroliter Flowsheath buffer fra Becton Dickinson (FACS-PBS) tilsat 0,5% bovint albumin. Til flowcytometrisk analyse overførtes 25 mikroliter af cellesuspensionen til et nyt rør, der vaskedes tre gange med FACS-PBS for at fjerne overskydende EMA. Til sidst resuspenderedes i 500 mikroliter FACS-PBS. Til den flowcytometriske analyse benyttedes en FACSCalibur (Becton Dickinson). Der benyttedes følgende parametre: Cellestørrelsen måltes ved log til forwardscatter -signalet (logFSC, tærskelværdi 500), granulering måltes ved log til sidescatter -signalet (logSSC) og fluorescensen måltes ved log til fluorescein isothiocyanate-signalet (logFITC). Før analyse af patientmaterialet blev flowcytometeret indstillet med beads (FluoroSpheres, Dako), således at den højeste top havde en middelfluorescensintensitet (MFI) på 1.500 ± 50. Patientprøvens FITC-MFI blev bestemt for 10.000 hændelser i en erytrocyt-gate (logFSC/logSSC). I hver analyseserie blev der medtaget en kontrolprøve med samme prøvetagningsdato som analyseseriens prøver (Figur 1 ). Resultatet udtryktes som forskellen i MFI mellem kontrol- og patientprøve ud fra følgende formel: EMA-procent = ((MFIkontrol - MFIprøve ) × 100/MFIkontrol ).

Resultater
Statistisk analyse

Ved flowcytometrisk analyse blev EMA-procent målt hos patienter med HS og sammenlignet med værdier, der var opnået hos en kontrolgruppe med andre hæmolytiske tilstande. Undersøgelserne viste, at fluorescensintensiteten var signifikant lavere ved HS sammenlignet med andre hæmolyser (p < 0,0001) illustreret ved en højere EMA-procent (Figur 2 ).

Vi valgte en tærskelværdi på 15% som udtryk for øvre normalgrænse. Værdier, der var større end 15% var diagnostiske for HS med en sensitivitet på 95% (95% konfidensinterval, 76-100%) og en specificitet på 93% (95% konfidensinterval, 76-99%).

Reproducerbarhed

Reproducerbarheden af resultaterne afhænger af opbevaring af patientprøver, holdbarhed af farvestoffet, EMA og inkubationstid. Holdbarhedsforsøg viste, at prøver, der blev opbevaret ved stuetemperatur, gav uændret fluorescens inden for de første 48 timer. En sammenligning af den fundne fluorescensintensitet hos otte personer umiddelbart efter prøvetagning og efter opbevaring af prøven ved stuetemperatur i 48 timer viste en korrelationskoefficient på 0,82 (Figur 3 ).

Analysevariation

Analysevariationen i samme serie er undersøgt ved at gentage samme patientprøve ti gange. Variationskoefficienten på MFI var i dette forsøg på 3,8%. EMA-pulveret (eosin-5'-maleimid, BioChemika, Sigma Aldrich) blev opløst i fosfatbuffer (pH 7,3-7,4) til en koncentration på 0,5 mg/ml og fordelt i et passende volumen (afhængigt af forventet prøveseriestørrelse). Efter hver analyseserie blev resterende EMA kasseret. Holdbarheden af EMA-reagenset ved -20°C blev undersøgt ved, at der den samme dag udførtes bestemmelser på tre prøver med nyt reagens og henholdsvis tre, seks og ti måneder gammelt reagens. Der var meget lidt variation i resultaterne uafhængigt af opbevaringsperiodens længde (0-10 måneder) (Figur 4 ). Herefter blev reagens opbevaret ved -20°C med en holdbarhed på mindst seks måneder.

Diskussion

HS bliver i dag diagnosticeret ved en kombination af klinik og biokemi suppleret med osmotisk resistensbestemmelse. Det er tidligere beskrevet, at kun 66% af ikke-splenektomerede patienter med HS har nedsat osmotisk resistens [8]. Ofte må undersøgelsen gentages ved en såkaldt inkuberet osmotisk resistensundersøgelse, hvor erytrocytterne forinden inkuberes i isotonisk NaCl i 24 timer for at øge sensitiviteten. Nedsat osmotisk resistens kan også ses hos patienter med hereditær elliptocytose og andre membranrelaterede hæmolyser [2] samt ved varme-antistofbetinget immunhæmolyse. Metoden er tidskrævende og kræver en betydelig rutine, hvorfor der er behov for en ny og bedre diagnostisk undersøgelse. Flowcytometrisk diagnostik er en hurtig og sensitiv metode til screening af patienter, der er mistænkt for HS [4-7]. Den biokemiske baggrund for HS er heterogen med defekter, typisk kvantitative, i cytoskeletproteinerne ankyrin, spektrin, protein 4.2 og bånd 3. Ved den flowcytometriske metode kvantiteres fluorescensintensiteten af erytrocytter efter inkubation med farvestoffet EMA. Ca. 80% af fluorescensen i de røde blodlegemer skyldes binding af farvestoffet til bånd 3, resten er bundet til sulfhydrylgrupper i integralproteiner, som er del af Rh-komplekset. Både bånd 3 og integralproteiner er nedsat ved HS. Den prædiktive værdi af reduceret binding af EMA til erytrocytterne ved HS baseres således på ændringer i det relative indhold af bånd 3 og Rh-associerede integralproteiner i erytrocytmembranen [6]. Der findes sjældne tilstande med kvalitative membranabnormiteter, såsom South-East Asian Ovalocytosis og Congenital Dyserythropoietic Anaemia type II , der som HS har reduceret fluorescens ved flowcytometri med EMA-mærkede erytrocytter, hvorfor det er vigtigt at sammenholde et resultat med nedsat fluorescens med den kliniske præsentation og biokemi [4]. Der er ikke påvist sammenhæng mellem fluorescensniveauet ved HS og den kliniske præsentation af sygdommen [4], ej heller af eventuel tidligere splenektomi [6].

Vi har med vores design af metoden valgt at udtrykke ændringen i fluorescensen som en fraktion i forhold til en normal kontrolperson, som medtages ved hver undersøgelse. Alternativet er at opgive et fluorescensinterval, hvor patienter med HS typisk ligger [4]. Sidstnævnte metode kræver en større kalibrering af flowcytometret for at reducere variationen fra dag til dag. Ved vores metode afbøder vi den usikkerhed, ved at værdien hele tiden refereres til en normalperson.

Vi har valgt en EMA-grænse for diagnosen HS på > 15%. Da vi er af den opfattelse, at vi med metoden skal kunne udelukke HS med høj sikkerhed, har vi valgt denne grænse, 20 af 21 patienter med dokumenteret HS lå over 15%. Den ene patient, der lå under grænseværdien, havde en EMEA-procent på 12. Sensitiviteten er derfor høj, men specificiteten lidt lavere. Der var to patienter med ikke-HS, som lå > 15%. Den ene havde β-thalassæmia major og den anden seglcelleanæmi. Ingen af de andre patienter i kontrolgruppen med enten talassæmi eller seglcelleanæmi var over 15%. Vi kan således ikke pege på en tendens til højere EMA ved andre sygdomme. Derfor kan EMA-binding ikke stå alene som garanti for HS, men må vurderes i sammenhæng med andre kliniske manifestationer. Det er vigtigt for reproducerbarheden, at farvestoffet EMA opbevares korrekt. Vores undersøgelser har vist, at holdbarheden ved -20°C er mindst seks måneder.

Specificitet- og sensitivitetsberegningerne er foretaget på et patientmateriale, hvor diagnosen HS er baseret på diagnostiske undersøgelser, som er tilgængelige rutinemæssigt i dag. Alle patienter havde nedsat osmotisk resistens og kliniske og parakliniske fund i øvrigt, der var forenelige med diagnosen HS, eksempelvis høj MCHC, Coombs-negativ hæmolyse, genetiske forhold, respons på splenektomi osv. Yderligere verificering af diagnosen HS kan kun opnås ved undersøgelserne SDS-PAGE og ektacytometri, der kun foretages få steder i forskningsmæssig sammenhæng. Dette har således ikke været muligt i denne undersøgelse. Vores undersøgelser illustrerer ikke en sammenligning af de to metoder, EMA-binding og osmotisk resistens. EMA-metodens styrke ved subkliniske tilfælde med normal osmotisk resistens kan derfor ikke afgøres i dette studium.

Sammenfattende har vi fundet, at den flowcytometriske metode med EMA-mærkede erytrocytter er en teknisk let tilgængelig metode med både høj sensitivitet og specificitet for diagnosen HS. Det anbefales derfor, at flowcytometrisk undersøgelse for HS erstatter den osmotiske resistensundersøgelse, hvor disse undersøgelser findes indicerede i udredningen af den hæmolytiske patient.

Summary

Flowcytometric diagnostics of hereditary spherocytosis

Ugeskr Læger 2009;171(49):3610-3614

Introduction: The diagnosis of hereditary spherocytosis (HS) is based upon clinical presentation, typical laboratory findings of haemolysis with an increased mean corpuscular haemoglobin concentration (MCHC) combined with a positive osmotic fragility result. The disorder is caused by structural defects in red cell cytoskeletal proteins. The dye eosin-5'-maleimide (EMA) binds to band three of the red cell membrane. The fluorescence intensity of EMA-labelled red cells can be quantified by flowcytometric analysis. Decreased fluorescence is found in patients with HS. We have evaluated this method by comparing flowcytometric analysis of red cells from patients with HS and patients with other haemolytic disorders.

Material and methods: We included 21 patients with HS and 27 patients with other haemolytic disorders. The red cells were incubated and labelled with EMA followed by flowcytometric analysis measuring the mean-fluorescence-intensity expressed as EMA perctentage.

Results: Based on the overall results, we assess an EMA percentage threshold of 15 or above to indicate HS. We found a sensitivity of 95% and a specificity of 93%.

Conclusion: The osmotic fragility test does not have the same high degree of sensitivity and specificity and the test is time-consuming in the laboratory setting. Flowcytometric analysis with quantification of fluorescence intensity of red cells labelled with the EMA dye has proven to be a rapid and user-friendly method available to any laboratory with a flowcytometer. The method has a high sensitivity and specificity and can be recommended as a diagnostic tool for HS.

Henrik Birgens , Hæmatologisk Afdeling L, Herlev Hospital, DK-2730 Herlev. E-mail: hebi@heh.regionh.dk

Antaget: 6. april 2009

Interessekonflikter: Ingen