Genetiske defekter i insulinsignaleringsproteiner

Patogenesen for type 2-diabetes er kompleks og omfatter ændringer i både sekretion og virkning af insulin. Disse ændringer skyldes et kompliceret samspil mellem genetik og miljø. Bestemmelse af de genetiske defekter, som disponerer til enten insulinresistens eller nedsat insulinsekretion, er vigtig, da en bedre forståelse af de underliggende molekylære mekanismer giver en øget indsigt i sygdommen og kan danne basis for en mere effektiv behandling. Denne artikel fokuserer på varianter fundet i gener, som koder for proteiner i den proksimale insulinsignaleringskaskade. Variationer er hyppigt forekommende i disse gener, men effekten af dem varierer ofte mellem forskellige populationer. Dette tyder på, at den genetiske baggrund har en stor betydning, og at en synergistisk effekt fra flere genvarianter spiller en stor rolle. Det er derfor vigtigt i fremtiden at udføre genetisk-epidemiologiske studier på store populationer for at opnå den nødvendige statistiske styrke. I artiklen diskuteres også den nyeste forskning, der foreslår, at insulin har en direkte effekt på b-cellens insulinsekretion, og at insulin i CNS er vigtig for regulering af energihomøostase.

Patogenesen for type 2 (ikke-insulinkrævende)-diabetes mellitus er kompleks og involverer abnormiteter både i virkningen af insulin i insulinfølsomme væv (insulinresistens) og i insulinsekretionen fra pancreas' b-celler (nedsat og forsinket insulinsekretion). Hvilken af de to biokemiske defekter der optræder primært og sekundært i den prædiabetiske tilstand, er stadig et emne for debat (1). Det er dog generelt accepteret, at både nedsat insulinstimuleret glukoseoptagelse (dvs. insulinresistens) samt nedsat pankreatisk b-cellerespons skal være til stede, for at manifest diabetes udvikles (1).

Årsagen til abnormiteterne ved diabetes skyldes et kompliceret samspil mellem gener og livsstilsfaktorer (2). Det genetiske bidrag til udvikling af insulinresistens, nedsat insulinsekretion og ultimativt til diabetes har længe været anerkendt. Genernes betydning er bl.a. demonstreret ved familiær ophobning, højere konkordansrate i monozygote sammenlignet med dizygote tvillinger samt høj prævalens af diabetes i visse etniske befolkninger (fx Pima indianere i Arizona) (3-5).

I de sidste 20 år er der gjort store fremskridt i forståelsen af insulinets virkning og sekretion på det molekylære plan. Forståelsen af de underliggende molekylære mekanismer er essentiel for få indsigt i sygdommen samt for at skabe en rationel basis for en effektiv behandling.

Denne artikel vil diskutere nogle af de varianter, der er fundet i gener, som koder for proteiner involveret i den proksimale intracellulære insulinsignaleringskaskade. Disse gener er udvalgt vha. kandidatgenmetoden, dvs. generne er valgt ud fra den biokemiske funktion af proteinet, de koder for. Et defekt gen formodes at kunne spille en rolle i udviklingen af diabetes eller de intermediære fænotyper af sygdommen. Desuden vil jeg kort diskutere den seneste forskning, der foreslår, at insulinsignalering er vigtig i andre væv end lever, muskel og fedt.

Intracellulær insulinsignalering

Insulin initierer sin virkning ved at binde sig til insulinreceptoren, der er placeret i plasmamembranen og består af en ekstracellulær, transmembran og intracellulær del (Fig. 1). Binding af insulin medfører aktivering af insulinreceptor-tyrosinkinasen og efterfølgende fosforylering af adskillige endogene substrater. Det første substrat blev påvist i 1992 og betegnet IRS-1 (insulin receptor substrate-1). Siden er der påvist en hel familie af insulinreceptor substrater (IRS-1-4, Gab1, Shc m.m.) (Fig. 1) (6).

Insulinreceptorsubstraterne er adapterproteiner uden enzymatisk funktion. Foruden af insulinreceptoren kan substraterne fosforyleres af adskillige andre receptorer, fx receptoren for insulin-like growth factor (IGF)-I, growth hormone (GH) og forskellige klasser af cytokinreceptorer (6).

IRS-1 og -2 er de bedst undersøgte molekyler i IRS-familien. IRS-1 og -2 er 45% identiske og indeholder begge omkring 22 tyrosiner med potentiale for at blive fosforyleret. Adskillige af tyrosinerne er placeret i domæner, som består af fire aminosyrer: YXXM eller YMXM (Y = tyrosin, M = metionin, X = hvilken som helst aminosyre) (7). Disse aminosyremotiver genkendes af proteiner, der indeholder Src-homology (SH)-2 domæner.

Genomstrukturen af human IRS-3 er ikke kendt, men muse- og rotte-IRS-3-gener er klonet. Derimod er human IRS-4 klonet, men betydningen af proteinet under insulinstimulering er stadig uklar.

Shc (navngivet for sit SH2-domæne og kollagenlignende domæne) er et substrat for alle receptor-tyrosinkinaser, vi kender i dag (8). Shc spiller en hovedrolle i den vækstfaktorinducerede, intracellulære kaskade, som fører til celledeling og celledifferentiering (Fig. 1).

Fosforylering af insulinreceptorsubstratproteiner fører til det næste trin i insulin-signaleringskaskaden. IRS kan binde til enzymer og adapterproteiner som indeholder SH2-domæner, og hermed sker en hurtig spredning i den intracellulære signalering (Fig. 1) (7). IRS-proteinerne binder bl.a. til PI 3-kinase (phosphatidylinositol 3-kinase), som er et heterodimert enzym opbygget af en katalytisk enhed (p110α/β) og en regulatorisk enhed (p85), der findes i mange splejsvarianter (9). PI 3-kinase spiller en vigtig rolle i insulin- og vækstfaktorstimuleret glukoseoptagelse, glykogensyntese og lipidsyntese (9).

Mange af de molekylære mekanismer, som fører til de endelige biologiske effekter af insulin, er endnu ikke klarlagt. Nye signaleringsproteiner og dermed nye signaleringsveje bliver jævnligt påvist. Fig. 1 viser en stærkt forenklet model, men faktum er, at der på hvert trin i kaskaden er mulighed for interaktion mellem adskillige proteiner, og hvert enkelt protein kan ofte forekomme i forskellige isoformer, hvilket medfører, at der reelt er hundredvis af signaleringsveje. Om dette netværk af proteiner er et tegn på »overflødighed« eller et »sikkerhedsnet«, hvor et protein kan tage over, hvis et andet ikke virker optimalt (evt. pga. en mutation), eller om hver signaleringsvej har sin helt egen virkning, er for tiden emnet for megen forskning.

Nye aspekter i insulinsignalering

Insulinreceptoren er udtrykt i næsten alle væv, indbefattet de mest kendte insulinfølsomme væv, lever, muskel og fedt. Men de seneste studier af transgene mus indikerer, at insulinreceptoren også spiller en vigtig rolle i pancreas' β-celler samt i nervevæv i centralnervesystemet, oprindelig ikke opfattet som klassisk insu linfølsomme væv.

Studier af transgene mus har vist, at neuronspecifik knock-out af insulinreceptoren i hjernen ikke medfører ændringer i hjernens udvikling, men musene har nedsat fertilitet, og hunmus er karakteriseret ved øget fødeindtagelse, og hos både hun- og hanmus ses øgede fedtdepoter, forhøjet plasmaleptin, mild insulinresistens, forhøjet plasmainsulin og forhøjede triglycerider (10). Insulinreceptorsignalering i CNS er således også vigtig for regulering af energihomøostase samt reproduktion.

Mus med specifik knock-out af insulinreceptoren i pancreas' b-celle har omtrent 100% reduktion i glukoseinduceret førstefase insulinrespons, hvilket kan tyde på, at defekter i insulinsignalering i β-cellen kan spille en rolle i de insulinsekretoriske ændringer, der er observeret i type 2-diabetes (11). Desuden har b-celler isoleret fra mus - med global IRS-1 knock-out en kraftig reduktion i glukoseinduceret insulinsekretion samt en tofold nedsættelse i ekspressionen af insulin (12). Ydermere har studier af IRS-2-knock-out-mus påvist, at dette protein har en vigtig rolle i regulering af β-cellemasse (13, 14), og at signaleringen i β-cellen sker via PI 3-kinase (15). Endvidere har en forskergruppe vist, at en en del af insulinsekretionen i β-cellen sker via en autokrin feedbackmekanisme (16). Disse nye hypoteser er vist skematisk i Fig. 2.

Genetisk variation i insulinsignaleringsproteiner

Hos type 2-diabetikere er virkningen af insulin forsinket og den insulinstimulerede glukoseoptagelse i skeletmuskulatur er reduceret med 40-50% sammenlignet med individer med normal glukosetolerance (17). Størstedelen af glukosen, der optages i musklen, bliver omdannet til glykogen, men hos diabetikere er der en klar hæmning af den insulinstimulerede glykogensyntese (18).

Som nævnt har de sidste års forskning givet os et større indblik i de molekylære mekanismer, der fører til insulins biologiske effekt. Men spørgsmålet er, hvor de molekylære defekter optræder hos personer, som er genetisk disponeret for diabetes, og hvor mange defekter der skal være til stede for at provokere sygdommen? I den seneste forskning foreslås, at de hyppige former for type 2-diabetes er polygenetiske, dvs. flere mutationer i flere gener skal optræde samtidig. Placeringen af disse kan i teorien forekomme på hvert enkelt trin i den intracellulære insulinsignaleringskaskade. I det følgende gennemgås resultaterne fra mutationsanalyse af nogle af disse gener.

Insulinreceptor. Insulinreceptoren selv er en oplagt kandidat, da den repræsenterer det trin i kaskaden, som er i direkte kontakt med insulin, og som overfører et ekstracellulært signal til et intracellulært. Genet, som koder for insulinreceptoren, er blevet undersøgt for mutationer, og der er fundet omkring 50 naturligt forekommende genetiske varianter, men disse varianter er oftest associeret med monogene former for ekstrem insulinresistens og kan ikke forklare genetikken bag de hyppigste former for type 2-diabetes (19).

IRS-1. Gener, der koder for proteiner tilhørende insulinreceptorsubstratfamilien, må også anses for at være yderst relevante kandidatgener. Vi undersøgte IRS-1 og fandt to nukleotidændringer, som medfører aminosyreændringer (Ala513Pro og Gly972Arg) (Fig. 3A) (20). Efterfølgende er der påvist mindst ti aminosyrevarianter i IRS-1.

Varianten i codon 972 er den hyppigst forekommende, og frekvensen blandt type 2-diabetikere og individer med normal glukosetolerance er bestemt i mere end 14 forskellige populationer (20-24). Bærerfrekvensen varierer betydeligt mellem populationerne (diabetikere: 1-23%, kontrolperson: 0-13%), men samlet er der ingen forskel mellem diabetikere og kontrolpersoner (frekvens omkring 8%). Til gengæld er det vist, at der er en interaktion mellem varianten og fedme (25). Unge, raske, overvægtige personer (BMI 25 kg/m2), som bærer varianten i heterozygot form, har 50% nedsættelse i insulinfølsomhed sammenlignet med unge overvægtige personer uden IRS-1-varianten (25). Codon 972 er placeret mellem to tyrosiner, som under fosforylering binder til PI 3-kinase (Fig. 3A). Udskiftningen af aminosyren glycin til arginin kan medføre en ændring i foldning af proteinet og dermed påvirke bindingen til PI 3-kinase. Denne hypotese blev testet ved at transfektere stamceller, som ikke udtrykker IRS-proteiner, med human-vildtype-IRS-1, samt med IRS-1 indeholdende 972-varianten. Resultaterne viste, at insulinstimuleret binding af muteret protein til p85α (den regulatoriske enhed af PI 3-kinase) var signifikant nedsat med 25% sammenlignet med binding af vildtype-protein til p85α (26). Den reducerede binding medførte en 36% reduktion i insulinstimuleret IRS-1-associeret PI 3-kinaseaktivitet. Det påvistes også, at den insulinstimulerede mitogenese var signifikant reduceret (med 32%) i celler, der udtrykte muteret IRS-1 (26).

I det primære studium af IRS-1 var bærere af varianten i codon 972 karakteriseret ved reduceret fasteseruminsulin og C-peptid, hvilket på daværende tidspunkt var overraskende, da det indikerer en β-cellefejl (20). Senere studier i insulinsecernerende RIN b-celler påviste, i overensstemmelse med de kliniske data, at celler, der overudtrykte IRS-1-varianten, havde nedsat glukosestimuleret insulinsekretion sammenlignet med celler, der overudtrykte vild-type-IRS-1 (27). Baseret på de ovennævnte studier samt den viden, vi har i dag om insulins betydning i β-cellen, må det formodes, at genetisk variation i IRS-1 kan resultere i ændringer både i insulinsekretion og i målvævene.

IRS-2. For få år siden blev genet, der koder for human-IRS-2, klonet, og vi påviste tre genetiske varianter (Leu647Val, Gly879Ser, Gly1057Asp) (Fig. 3B) (28, 29). Ændringen af glycin til asparaginsyre i codon 1057 forekommer i 50% af personerne i den undersøgte, danske population. Glukosetolerante, midaldrende personer, som var bærere af varianten i homozygot form, havde signifikant nedsat fasteseruminsulin, sammenlignet med vildtypebærer, hvilket også var gældende efter 30 og 60 minutter under en oral glukosetolerancetest. Disse reduktioner kunne ikke påvises i de andre undersøgte populationer (29). Et nylig publiceret studium har vist en interaktion mellem fedme og IRS-2-varianten, hvor der ses en øget risiko for diabetes hos overvægtige bærere (30).

En ung, slank mand var homozygot for IRS-1 (Gly972Arg) og IRS-2 (Gly1057Asp) varianterne. Han var karakteriseret ved seruminsulin- og C-peptidniveauer, der var reduceret med henholdsvis 74% og 56% sammenlignet med 50 aldersmatchede unge mænd. Ydermere var insulinfølsomheden nedsat med 45%. Den dobbelt homozygote mand, samt fem mænd med vildtype-IRS-1-proteiner, fik foretaget en dexamethason-suppressionstest. Ved slutningen af testen udviklede den homozygote mand en transient diabetes, som remitterede fuldstændigt efter seponering af dexamethason (25, 29).

Det skal her nævnes, at ovennævnte fænotype ikke på nuværende tidspunkt kan bevises eller afvises at være et resultat af personens genotype. Der kræves en væsentlig større population for at opnå et tilfredsstillende antal bærere. Ydermere burde genetiske varianter altid undersøges i et funktionelt studium for at bevise, at der er tale om selve »sygdomsmutationen« og ikke en genetisk polymorfi, som er i linkage til den sygdomsfremkaldende variant. I tilfældet med IRS-2 har det ikke været muligt at udføre en funktionel test af codon 1057-varianten, da det ikke er lykkedes at klone human-IRS-2-ind i en ekspressionsvektor.

IRS-4. Genet for human IRS-4 indeholder, ligesom IRS-1 og -2, adskillige aminosyrevarianter (Fig. 3C) (31). Ingen af varianterne er i sig selv associeret med type 2-diabetes eller intermediære fænotyper af diabetes. Det er dog interessant, at genet der koder for IRS-4, er placeret på X-kromosomet. En opsplitning i køn af den undersøgte population viste ingen forskelle mellem bærere og ikke-bærere inden for hvert køn (31).

Shc. Epidemiologiske studier har vist, at der er en sammenhæng mellem nedsat fødselsvægt og udvikling af diabetes (32). Da Shc spiller en vigtig rolle i den intracellulære signalering, som fører til celledeling og celledifferentiering, blev genet anset for en mulig kandidat i patogenesen for type 2-diabetes. En aminosyreændring blev påvist (Met300Val) (Fig. 3D), som ikke var associeret med diabetes eller nedsat insulinsensitivitet blandt danskere (33). Dog var fødselsvægten hos heterozygote drenge 179 g lavere sammenlignet med drenge med vildtype Shc (33). Varianten bør derfor undersøges i et større materiale.

PI 3-kinase. PI 3-kinaseaktiviteten er vigtig for den metaboliske virkning af insulin (34), og derfor blev genet, som koder for p85α (den regulatoriske del af proteinet) betragtet som et kandidatgen. En aminosyrevariant blev påvist (Met326Ile), som optræder lige hyppigt hos diabetikere og glukosetolerante kontrolpersoner (35, 36) (Fig. 3E). Aminosyresubstitutionen er i nogle studier blevet associeret med ændringer i glukose- og insulinhomøostase, dog med forskellig effekt afhængig af den undersøgte population, hvilket indikerer, at den genetiske baggrund spiller en rolle (35-37).

Varianten er placeret tæt på et SH2-domæne (Fig. 3E), som interagerer med IRS-1. Vi testede ekspressionsniveau af muteret og vildtypeprotein samt bindingen til IRS-1 i yeast two-hybrid-systemet og i brune præadipocytter isoleret fra p85αknock-out-mus. Både i gær og præadipocytter fandt vi en reduktion i ekspressionen af muteret p85α sammenlignet med vildtypeprotein. Desuden var bindingen af muteret p85α til IRS-1 øget i begge systemer i forhold til bindingen mellem vildtype p85α og IRS-1 (ikke-publicerede observationer, K. Almind et al). Mus, som er heterozygote for p85α-genet (dvs. har ca. 50% reduktion i p85α-molekyler), har øget glukosehomøostase, formentlig pga. en forbedret støkiometri mellem IRS-1 og p85α (F. Mauvais-Jarvis et al, ikke-publiceret observation). Disse data kan måske forklare hvorfor aminosyresubstitutionen i p85α kan medføre ændringer i insulinsignalering.

Konklusion og perspektiver

Foruden de nævnte studier er der undersøgt mere end 60 kandidatgener for mulig betydning i patogenesen for type 2-diabetes og/eller fedme. Størstedelen af studierne mangler funktionelle undersøgelser samt undersøgelser af genernes promotorregioner og andre utranslaterede regioner. Ydermere er de fleste studier af kandidatgener udført på små populationer, hvilket gør det svært at konkludere, om et gen reelt er et susceptibility-gen i type 2-diabetes (et diabetogen). Gener, der ikke optræder med en patogenetisk betydning i en mindre population, er blevet udelukket.

Den nylige publicering af den humane genomsekvens giver os bedre mulighed for at udføre scanninger af det totale genom og dermed en øget sandsynlighed for at påvise kromosomale regioner, der er associeret med type 2-diabetes (38, 39). Anvendelse af begge metoder (total genomscanning og kandidatgenmetoden) er nødvendig for at finde diabetogenerne.

Type 2-diabetes er en yderst kompleks sygdom, og der er voksende enighed om, at den hyppigste form for diabetes skyldes en synergistisk effekt fra adskillige gener foruden effekten fra miljøforhold som for megen mad og for lidt motion, der tilsammen påvirker sygdomsudviklingen. I fremtiden er det nødvendigt at undersøge kandidatgener i langt større populationer for at opnå den statistiske styrke, der skal til for at kunne anvende den genetisk-epidemiologiske fremgangsmåde. Det bliver dermed muligt at teste for gen til gen-interaktioner og gen til miljø-interaktioner. Studiet af varianterne i IRS-1 og -2 er kun en begyndelse.

Katrine Almind, Joslin Diabetes Center, One Joslin Place, Boston, MA 02215, USA.

E-mail: katrine.almind@joslin.harvard.edu

Antaget den 14. juni 2001.

Research Division, Joslin Diabetes Center and Department of Medicine, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.

Litteratur

1. Ferrannini E. Insulin resistance versus insulin deficiency in non-insulin-dependent diabetes mellitus: problems and prospects. Endocr Rev 1998; 194: 477-90.
2. Pedersen O. Insulin resistance: The evidence for a genetic component. I: Hitman GA. Type 2 diabetes: prediction and prevention. Chichester: Wiby, 1999: 85-106.
3. Poulsen P, Kyvik KO, Vaag A, Beck-Nielsen H. Heritability of type II (non-insulin-dependent) diabetes mellitus and abnormal glucose tolerance - a population-based twin study. Diabetologia 1999; 42: 139-45.
4. King H, Rewers M. Global estimates for prevalence of diabetes mellitus and impaired glucose