Genterapi af svær kombineret immundefekt

Mangel på enzymet adenosin-deaminase (ADA) forårsager en arvelig form af svær kombineret immundefekt (servere combined immunodeficiency (SCID)). Normalt nedbryder enzymet purinstofskiftets metabolitter adenosin og deoxyadenosin, som ophobes ved ADA-mangel. Metabolitterne er i høje koncentrationer toksiske for lymfocytter, hvilket giver anledning til immundefekten [1].

Den nuværende førstevalgsbehandling af sygdommen er knoglemarvstransplantation fra en human leucocyte antigens (HLA)-matchende donor, men en egnet donor er kun tilgængelig for 20-33% af patienterne [1, 2]. Hvis der ikke kan findes en sådan donor, kan der gives substitutionsbehandling med modificeret bovint ADA (PEG-ADA). Dette bedrer ofte patienternes tilstand initialt, men immunfunktionen kan sjældent opretholdes gennem længere tid, da patienterne kan udvikle antistoffer imod det bovine enzym. Der kan også forsøges med knoglemarvstransplantation fra ikkebeslægtede eller haploidentiske donorer (forældre), men i de tilfælde er mortaliteten høj (henholdsvis 37% og 70%) [3].

Allerede i 1980'erne var der interesse for ADA-SCID som en mulig kandidat for behandling med genterapi. Dette skyldtes bl.a., at resultater tydede på, at få transplanterede celler kunne give fuld immunrestitution.

I 1990'erne publicerede flere grupper kliniske forsøg med genterapi ved brug af genmodificerede T-celler [4] og hæmatopoietiske stamceller [5, 6]. Efter behandlingen kunne der måles ekspression af ADA i de genmodificerede celler, men ingen af patienterne kunne klare sig uden PEG-ADA [4].

Lovende resultater med ADA-SCID

Aiuti et al publicerede i 2002 de første positive resultater med genterapi uden samtidig behandling med PEG-ADA [7]. To patienter blev behandlet med autolog transplantation af hæmatopoietiske stamceller, der ex vivo fik ADA-genet overført med murine retrovirale vektorer (Figur 1 ). Desuden fik patienterne konditionerende behandling med en lav dosis busulfan, der hindrer celledelingen og ser ud til at gøre knoglemarven bedre til at modtage de genmodificerede celler.

I 2009 publicerede Aiuti et al [8] nye resultater, nu med i alt ti patienter. To af disse patienter var de samme, som blev beskrevet i 2002, og nu var yderligere otte patienter medtaget i opgørelsen. Det blev rapporteret, at otte af de ti patienter havde fået varig bedring af immunforsvaret og ikke behøvede behandling med enzymsubstitution.

Et år efter behandlingen kunne man finde de nye ADA-gener i henholdsvis 52%, 59% og 88% af B-, natural killer (NK)- og T-cellerne i blodet. ADA-aktiviteten i erytrocytter, T-celler og mononukleære celler var betydeligt højere end ved forsøgets start, og koncentrationen af adenosin-metabolitter i erytrocytter var reduceret og holdt sig lav i resten af observationsperioden. Samtidig steg det samlede antal af henholdsvis T-, B- og NK-celler i blodet, og var efter tre år signifikant højere end før behandlingen. Hos fem patienter var antallet af T-celler over den normale nedre grænseværdi. T-cellerne udviste proliferativt respons mod mitogener og hos de fleste patienter ligeledes mod candida, tetanustoksin og alloantigener. Desuden kunne der påvises reaktivering af thymus' aktivitet, idet der blev målt en stigning i antallet af cirkulerende naive T-celler.

Alle patienter er i dag i live. De ni patienter, der kunne evalueres, har fået det bedre, de kan omgås andre mennesker og har færre infektioner. To af patienterne har brug for behandling med PEG-ADA. Den ene af disse fik den laveste dosis genmodificerede stamceller, den anden havde inden forsøgets start autoimmun hæmolytisk anæmi og fik efter behandlingen autoimmun trombocytopeni. Denne patient fik efter få måneder genoptaget PEG-ADA-behandlingen og blev ikke yderligere evalueret.

De observerede bivirkninger var neutropeni, som hos to patienter varede over 30 dage, trombocytopeni, hypertension (en patient), centralt venekateter (CVK)-infektion (to patienter), Epstein-Barr-virus-reaktivering (en patient) og autoimmun hepatitis (en patient). Der sås ingen tilfælde af leukæmi eller anden klonal ekspansion af de genmodificerede celler.

Hvorfor det denne gang er lykkes at opnå bedret immunfunktion og vedvarende lav koncentration af metabolitter hos otte ud af ti patienter, så de ikke har behov for enzymsubstitution, kan have flere årsager. En årsag kan være, at der i dette forsøg ikke blev givet PEG-ADA samtidig. Den deraf følgende højere koncentration af toksiske metabolitter giver en vækstfordel for de genmodificerede celler [6, 9]. Andre muligheder er brugen af mild konditionering, samt mere effektiv genoverførsel [8].

Genterapi af X-bunden form for svær kombineret immundefekt

I 2000 troede man, at man succesfuldt kunne behandle en anden form for arvelig immundefekt med genterapi, da Cavazzana-Calvo et al [10] i et forsøg, der blev udført i Paris, beskrev fuld immunrestitution hos børn med den X-bundne form for SCID. Imidlertid udviklede fire af de ti behandlede patienter senere T-celle-leukæmi. Analyse af de klonale celler tydede på, at en mulig årsag var vektorintegration i nærheden af LMO2-genet, der kan klassificeres som et protoonkogen. Hos en patient var integrationen i nærheden af et andet protoonkogen, CCND2. En af patienterne døde som følge af leukæmien [11]. Lignende resultater er beskrevet i et forsøg, der blev udført i London [12]. I det forsøg udviklede en ud af ti patienter leukæmi, og også her sås integration nær LMO2-genet [13].

Vektorintegration

I forsøget med genterapi af ADA-SCID har Aiuti et al [14] analyseret den retrovirale vektors integration i både de hæmatopoietiske stamceller og cellerne i det perifere blod. Herved kunne man undersøge risikoen for, at der senere vil opstå lignende alvorlige bivirkninger som i forsøget med X-bunden SCID. Man fandt, at integrationen i genomet ikke er tilfældig. Foretrukne steder er især gentætte områder, promotorer og højt udtrykte gener. Der er, ligesom ved X-bunden SCID, fundet integration nær protoonkogenet LMO2 og gener, der styrer cellevæksten, men det har ikke resulteret i klonal ekspansion hos disse patienter.

Dette kunne tyde på, at integration nær LMO2 ikke er tilstrækkelig til at medføre leukæmi, men at yderligere mutationer eller andre påvirkninger er nødvendige [11, 13].

Årsager til leukæmiudvikling ved X-bunden servere combined immunodeficiency

Hvorfor udvikling af leukæmi ses ved den X-bundne form og ikke hos patienter med ADA-SCID er ikke endeligt fastlagt, men der kan være flere forklaringer.

En årsag kan være forskellen på de indsatte gener [8]. ADA er et husholdningsgen, hvis genprodukt indgår i purinmetabolismen [1]. Genet, der overføres ved X-bunden SCID er IL2RG, som koder f or IL-2-receptorens γ-kæde [10]. Proteinet opreguleres ved T-celleaktivering og inducerer T-celleproliferation, når g-kæden interagerer med receptoren for forskellige cytokiner, dvs. at proteinet i sig selv kan give anledning til hastig vækst af T-celler [8]. Dave et al [15] har beskrevet, at de ændringer i ekspressionen af IL2RG, der ses, når dette udtrykkes af en vektor, der er baseret på retrovirus, kan have en sådan effekt på differentiering og vækst af cellerne, at IL2RG-genet bliver onkogent. Hvis en celle får genet integreret nær et protoonkogen, som f.eks. LMO2, kan der være basis for, at IL2RG og LMO2 kan samarbejde om udviklingen af leukæmi.

Ifølge en anden mulig forklaring, der er baseret på en række dyreforsøg, er det sygdommen X-bunden SCID i sig selv, der giver øget risiko for udvikling af leukæmi efter genterapi. Det kan skyldes, at den hurtige ufysiologiske proliferation af genmodificerede celler, der ses efter genterapien, kan give øget risiko for ophobning af mutationer og klonal selektion. Kombineres dette med integration nær et protoonkogen, øges risikoen yderligere [16].

Klonal udvikling ved kronisk granulomatøs sygdom

Endnu en immundefekt, der er blevet forsøgt behandlet med genterapi, er kronisk granulomatøs sygdom (CGD). Denne sygdom skyldes mutation i et af de gener, der koder for et af de fire subunits i NADPH-komplekset, hvilket resulterer i nedsat antimikrobiel aktivitet i fagocytter pga. manglende produktion af superoxider. En stor del af CGD udgøres af den X-bundne form, hvor genet, der koder for gp91phox -subunit 'en er defekt [17].

Ott et al [18] beskrev i 2006 behandling af to patienter med CGD med konditionering med busulfan og genterapi med murine retrovirale vektorer, der indeholdt genet for gp91phox . Hos begge patienter sås genmodificerede celler i blodet med funktion af NADPH, samt klinisk bedring. Dog sås ikke fuld immunrestitution, og den ene patient døde efter 2,5 år af sepsis. Der var på dette tidspunkt stort set ingen gp31phox -ekspression [17]. Hos begge patienterne fandt man klonal ekspansion af myeloide celler efter vektormedieret aktivering af vækstfremmende gener. Dette var ikke forventeligt, da man i forsøg med mus ikke havde fundet lignende klonal ekspansion.

Hvorfor en sådan ekspansion kunne ses, er ikke klarlagt, men det kan skyldes selve sygdommens og/eller transgenets natur eller brugen af mobiliserede CD34+-celler i stedet for celler, der er isoleret direkte fra knoglemarven [8]. Det, der er mest mistænkt, er dog brugen af en promotor, der virker meget effektivt i hæmatopoietiske stamceller, og som derfor kan være ansvarlig for aktivering af gener i nærheden af integrationsstedet [18].

Konklusion

Genterapi af arvelig svær kombineret immundefekt har været længe undervejs, og nyligt opnåede resultater med genterapi af en af formerne, ADA-SCID, er lovende. På baggrund af tidligere forsøg med behandling af X-bunden SCID, hvor der er set udvikling af leukæmi pga. aktivering af gener omkring integrationsstedet [11], er der lavet en grundig analyse af vektorintegrationen hos ADA-patienterne. Ligesom ved genterapi af X-bunden SCID blev der fundet integration nær protoonkogener, men dette har ikke givet anledning til klonal ekspansion [14]. Det kan ikke på nuværende tidspunkt afvises, at der vil komme lignende alvorlige bivirkninger hos ADA-patienterne [8]. En mulig forbedring, der kan øge sikkerheden, er brug af forbedrede vektorer. Noget tyder på, at vektorer, der er baseret på lentivirus, er mere sikre end de hidtige benyttede vektorer, der er baseret på murine retrovirus, idet lentivirale vektorer integrerer mindre selektivt omkring vigtige gener og dermed giver lavere risiko for utilsigtet genaktivering [19]. Sammenlignet med de øvrige behandlingsmuligheder for patienter med denne form for SCID, hvor der ikke kan findes en HLA-matchende donor, er genterapi et alternativ, der fortjener yderligere undersøgelse og udvikling [2, 8]. Behandlingen blev af det europæiske lægemiddelagentur, European Medicines Agency , i 2005 tildelt orphan drug-status.

Line Barrett Petersen , Paludan Müllersvej 37, 1. th., 8210 Århus V. E-mail: line.barrett@studmed.au.dk

Antaget: 11. august 2009

Først på nettet: 25. januar 2010

Interessekonflikter: Ingen

En fuldstændig litteraturliste kan fås ved henvendelse til forfatterne.

1. Hirschhorn R. Overview of biochemical abnormalities and molecular genetics of adenosine deaminase deficiency. Pediatr Res 1993;33:S35-41.
2. Kohn DB, Candotti F. Gene therapy fulfilling its promise. N Engl J Med 2009;360:518-21.
3. Antoine C, Muller S, Cant A et al. Long-term survival and transplantation of haemopoietic stem cells for immunodeficiencies: report of the European experience 1968-99. Lancet 2003;361:553-60.
4. Blaese RM, Culver KW, Miller AD et al. T lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID: initial trial results after 4 years. Science 1995;270:475-80.
5. Bordignon C, Notarangelo LD, Nobili N et al. Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA-immunodeficient patients. Science 1995;270:470-5.
6. Kohn DB, Hershfield MS, Carbonaro D et al. T lymphocytes with a normal ADA gene accumulate after transplantation of transduced autologous umbilical cord blood CD34+ cells in ADA-deficient SCID neonates. Nat Med 1998;4:775-80.
7. Aiuti A, Slavin S, Aker M et al. Correction of ADA-SCID by stem cell gene therapy combined with nonmyeloablative conditioning. Science 2002;296:2410-3.
8. Aiuti A, Cattaneo F, Galimberti S et al. Gene therapy for immunodeficiency due to adenosine deaminase deficiency. N Engl J Med 2009;360:447-58.
9. Aiuti A, Vai S, Mortellaro A et al. Immune reconstitution in ADA-SCID after PBL gene therapy and discontinuation of enzyme replacement. Nat Med 2002;8:423-5.
10. Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G et al. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science 2000;288:669-72.
11. Hacein-Bey-Abina S, Garrigue A, Wang GP et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest 2008;118:3132-42.
12. Gaspar HB, Parsley KL, Howe S et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet 2004;364:2181-7.
13. Howe SJ, Mansour MR, Schwarzwaelder K et al. Insertional mutagenesi s combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest 2008;118:3143-50.
14. Aiuti A, Cassani B, Andolfi G et al. Multilineage hematopoietic reconstitution without clonal selection in ADA-SCID patients treated with stem cell gene therapy. J Clin Invest 2007;117:2233-40.
15. Dave UP, Jenkins NA, Copeland NG. Gene therapy insertional mutagenesis insights. Science 2004;303:333.
16. Shou Y, Ma Z, Lu T et al. Unique risk factors for insertional mutagenesis in a mouse model of XSCID gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:11730-5.
17. Alexander BL, Ali RR, Alton EW et al. Progress and prospects: gene therapy clinical trials (part 1). Gene Ther 2007;14:1439-47.
18. Ott MG, Schmidt M, Schwarzwaelder K et al. Correction of X-linked chronic granulomatous disease by gene therapy, augmented by insertional activation of MDS1-EVI1, PRDM16 or SETBP1. Nat Med 2006;12:401-9.
19. Montini E, Cesana D, Schmidt M et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat Biotechnol 2006;24:687-96.