Identificering af nye ovariecancerbiomarkører med massespektrometriske proteomanalyser - fremtidens diagnostiske redskab?

Nye noninvasive test til diagnosticering af ovariecancer (OC) i tidlige stadier vil kunne bidrage til forbedret overlevelse af patienterne med OC. Proteomundersøgelse af serum eller urin kan være den eftersøgte metode. I præliminære udenlandske undersøgelser af proteomprofiler fra serum og urin har man påvist, at de har større prædiktiv værdi end kombinationen af serum CA125 og ultralyd, som benyttes præoperativt til OC-diagnostik. Identifikation af nye OC-proteombiomarkører med høj sensitivitet og specificitet vil optimalt kunne anvendes til både differentialdiagnostik og screening for OC.

Danmark har den højeste incidens af ovariecancer (OC) i verden og den højeste dødelighed blandt de nordiske lande [1, 2]. Hvert år diagnosticeres der ca. 600 tilfælde af OC hos danske kvinder. Ca. 80% af alle OC-tilfælde diagnosticeres i International Federation of Gynecology & Obstetrics (FIGO)-stadie IIIC-IV [3], hvor femårsoverlevelsen kun er 5-20% [1, 2]. Sen symptomdebut og mangel på en valid screeningsundersøgelse er nogle af de væsentligste årsager til, at størstedelen af ovariecancertilfældene diagnosticeres i et sent stadium.

For at øge andelen af epiteliale OC-tilfælde, der bliver diagnosticeret i de tidlige stadier, kræves der en ny diagnostisk platform. Serum-cancerantigen 125 (CA125), som er den mest benyttede OC-biomarkør, har både en lav specificitet og sensitivitet [4, 5]. Bruges CA125 som eneste markør i screeningsundersøgelser, har den en positiv prædiktiv værdi på under 10% [4, 5].

Serum CA125, ultralydfund og menopausestatus anvendes til udregning af Risk of Malignancy Index (RMI), hvorved ondartede tumorer i det lille bækken forsøges skelnet fra godartede tumorer. I et dansk studium opgør man sensitiviteten til at være 70% og specificiteten til at være 87% ved brug af RMI på operationspatienter med udfyldning i det lille bækken [6]. I øjeblikket er det fortsat nødvendigt med en eksplorativ laparatomi til eksakt diagnosticering af OC.

En optimal præoperativ markør vil medføre tidlig selektering af patienter til gynækologisk-onkologisk ekspertise, hvilket i sig selv vil forbedre overlevelsen [7]. Samlet vil man både opnå forbedret overlevelse og resursefordeling til opfyldelse af målene i Kræftplan II [8].

Den igangværende biomarkørforskning har som hovedformål at finde markører med høj sensitivitet og høj specificitet. Biomarkøren behøver ikke nødvendigvis at stamme fra en tumor. Den kan være et resultat af sygdomsspecifik og posttranslationel modifikation af bundne proteiner i vævsvæsker, hvilket gør proteomic til en nærliggende metode til identifikation af nye biomarkører ved såvel maligne som benigne sygdomme.

Formålet med nærværende artikel er at give en oversigt over principperne ved massespektrometriske proteomanalyser (SELDI-TOF) og deres anvendelighed inden for klinisk OC-diagnosticering.

Metode

Der er søgt i MEDLINE/Pubmed med følgende søgeord: ovarian cancer, proteomic, biomarker, serum, urine, MALDI- TOF-MS, SELDI-TOF-MS.

Proteommetodologi

Proteomet kan analyseres med traditionel todimensional gelelektroforese, men analyseres i større kliniske studier hovedsageligt med et massespektrometer [9-11]. Et beskedent krav til mængden af prøvemateriale i kombination med høj ana-lysehastighed gør massespektrometret velegnet til kliniske studier. Til proteomanalyse anvendes hovedsageligt to mas-se-spektrometriske analysemetoder matrix assisted laser desorption/ionisation time-of-flight massespectrometry (MALDI-TOF-MS) og surface enhanced laser desorption/ionisation time-of-flight massespectrometry (SELDI-TOF-MS) [12]. Forskellen på MALDI-TOF-MS og SELDI-TOF-MS ligger primært i måden, som prøvematerialet bearbejdes på, og i det software, som benyttes til bearbejdning af data [12]. Ved MALDI-TOF-MS forberedes prøvematerialet ved tilsætning af matrix, inden det appliceres på en passiv overflade, hvorimod prøvematerialet appliceres direkte på en aktiv overflade ved SELDI-TOF-MS [12]. På grund af den aktive overflade og høje sen-sitivitet benyttes SELDI-TOF-MS hyppigst ved detektion af nye proteombiomarkører. Metoden er valideret som værende reproducerbar [13].

Når nye og ukendte biomarkører skal detekteres, forsøger man initialt rent kvantitativt at kortlægge så stor en del af proteomet som muligt. Dette gøres ved at anbringe prøvematerialet på et bredt udvalg af forskellige proteinchip, som er beklædt med enten et kemisk eller et biologisk materiale. Baseret på generelle egenskaber som f.eks. ladning eller hydrofobicitet vil proteinchippen have høj affinitet til forskellige proteingrupper i prøvematerialet. I massespektrometret beskydes protein-matrix-krystallerne med en nitrogenlaser, hvorved proteinerne ioniseres, desorberes og accelereres mod en detektor i den anden ende af massespektrometrets vacuumrør (Figur 1). »Flyvetiden« måles og mass to charge- ratioen (m/z) udregnes automatisk. Ud fra proteinvægt og proteinintensitet genereres en proteinprofil af prøvematerialet.

Til identifikation af nye biomarkører sammenlignes proteinprofilerne fra raske og syge personer i kliniske studier (Figur 2). Pilotstudier identificerer først alle signifikante profilforskelle mellem raske og syge personer som værende potentielle biomarkørkandidater. Proteinerne kan således være enten op- eller nedregulerede hos de syge i forhold til hos de raske personer, eller profiler kan eksempelvis kun eksistere i en af grupperne. I en efterfølgende valideringsfase mindskes listen af potentielle biomarkørkandidater, og kun biomarkører med høj sensitivitet og specificitet vil blive identificeret ved sekvensanalyse og match i en proteindatabase. Identificerede nye biomarkører bliver efter yderligere validering videreudviklet til et assay, baseret på SELDI-TOF eller en mere traditionel klinisk diagnostisk platform (f.eks. ELISA).

Reproducerbarhed af proteomprofiler fra serum og urin

I 2002 publicerede Petricoin et al et banebrydende studium, hvori de anvendte SELDI-TOF-MS til diagnosticering af patienter med OC ud fra serum [14]. I studiet beskrives en sensitivitet på 100% (95% konfidensinterval (KI): 93-100%), en specificitet på 95% (95% KI: 87-99%) og en positiv prædiktiv værdi på 94% (95% KI: 84-99%), når OC identificeres i forhold til kvinder uden cancer. På trods af at Petricoins resultater ikke var reproducerbare [15], har studiet haft stor international betydning og dannet basis for eftertidens videreudvikling af proteomanalyser.

Fra tidligere undersøgelser af OC-biomarkører i serum ved man, at stabiliteten af en markør kan afhænge af behandlingsproceduren af prøvematerialet inden analyse [16-19]. I metodearbejde, der beskriver betydningen af håndtering og opbevaring af serum og plasma for stabilitet af proteomspektre, har man påvist, at prøvematerialet skal behandles ens med hensyn til opbevaringstemperatur og tid inden nedfrysning [20].

Der har været interesse for kortlægning af det humane urinproteom på grund af den noninvasive prøveindsamling og muligheden for indsamling af større og gentagne mængder urin. Sammenlignet med serum har urin både fordele og ulemper i relation til proteomundersøgelser ved OC-diagnostik. Urin er mindre proteinholdigt og har en højere saltkoncentration, hvilket gør forbehandlingsproceduren ved urin mere tidskrævende [21]. Men de lavmolekylære og mindre komplekse urinproteiner/peptider har imidlertid vist sig at have en højere termodynamisk stabilitet og være mindre interaktive end proteiner/peptider fra serum, hvilket teoretisk set gør urin til et lovende materiale ved massspektrometriske undersøgelser [22-24]. Indtil videre foreligger der kun få, mindre studier, hvori man beskriver henholdsvis eksterne og interne faktorers [25] samt opbevaringstidens påvirkning af stabiliteten ved SELDI-TOF-MS-analyse af urin [26]. Ingen af studierne danner grundlag for standardisering af proceduren ved urinproteomanalyse.

Proteom-ovariecancerbiomarkører

Inden for OC-diagnostik er hovedsagelig SELDI-TOF-MS anvendt til karakteriseringer af biomarkører [27-29]. Nedenstående uddybes de største kliniske SELDI-TOF-MS-proteomstudier til identifikation af potentielle OC-biomarkører (Tabel 1). På grund af forskellige udregningsmetoder er sensitiviteten og specificiteten i de tre studier ikke sammenlignelig. Derfor er der i Tabel 1 tilføjet et estimeret arealet under kurven for alle studierne.

Zang et al identificerede i 2004 tre biomarkører til diagnosticering af tidlige stadier af OC fra serumproteomanalyser med SELDI-TOF-MS [27]. De tre biomarkører blev valideret i en case-kontrol-undersøgelse med deltagelse fra fem centre. Undersøgelsen inkluderede i alt 153 kvinder med epitelial OC, 42 med andre OC-typer, 166 med benigne udfyldninger i bækkenet og 142 raske donorer [27]. Data fra to af centrene blev først analyseret uafhængigt af hinanden, hvorefter resultaterne blev krydsvalideret ved brug af data fra endnu to andre centre. Efter identifikation af proteinerne blev de biomarkører, hvor en immuno-assay var mulig, testet med prøverne fra det femte center. Tre serumbiomarkører til diagnosticering af tidlig OC blev identificeret: apolipoprotein A1 (ApoA1) (nedreguleret), en trunkeret form af transthyretin (TTR) (nedreguleret) og et kløvet fragment af inter-α-trypsin-inhibitor heavy chain H4 (ITIH4) (opreguleret). I en multivariatmodel, hvori man kombinerede de tre biomarkører og CA125, fandtes en sensitivitet på 74% (95% KI: 52-90%), hvilket var højere end sensitiviteten på 65% (95% KI: 43-84%), som fandtes for CA125 alene med en matchet specificitet på 97% (95% KI: 89-100%). Ved sammenligning med en fast sensitivitet på 83% (95% KI: 61-93%) var modelspecificiteten signifikant bedre end for CA125 alene, idet den var på 52% (95% KI: 39-65%).

Kozak et al har efterfølgende karakteriseret et panel på fem markører med SELDI-TOF-MS til diagnosticering af tidlig OC [28]. Markørerne består af to isoformer af TTR, betahæmoglobin (beta-Hb), ApoA1 og transferrin (TF). Ved multivariat analyse fandt man også her en forbedret sensitivitet og specificitet ved diagnostik af tidlig OC med panelet af de fem biomarkører i forhold til CA125 alene [28].

I januar 2006 publicerede Ye et al den første undersøgelse af identificerede urinproteomprofiler fra OC-patienter [29]. Præoperativ urin fra følgende patientkategorier blev indsamlet: 128 patienter med epitelial OC 24 med benigne ovariecyster, 28 med endometriose, 24 med anden gynækologisk cancer, 22 med cystitis, 12 med renal cancer og 20 med anden ikkegynækologisk cancer. Til kontrol blev urin fra disse patienter matchet med urin fra 188 aldersmatchede raske kvinder. Proteomanalyserne blev lavet som en two-step-analyse. Først blev forskelle i proteomprofiler mellem OC-patienter og patienter uden cancer analyseret med SELDI-TOF-MS og todimensional gelelektroforese, og potentielle biomarkørkandidater blev evalueret med antistofbestemmelse og ELISA-assay. Dernæst blev assay'et brugt til screening af urinprøver, der var indsamlet fra OC-patienter, fra kontrolpatienter, der havde andre cancertyper eller benigne lidelser, og raske kvinder. Ye et al fandt en signifikant højere protein-peak-intensitet for isoformer af eosinofilderiveret neurotoksin (glykosyleret EDN) og osteopontin (COOH-terminal kløvet osteopontin) hos patienter med tidlige stadier af OC. Sammenlignet med raske kontrolpersoner fandt Ye et al en sensitivitet på 72% og en specificitet på 93% ved kombination af de to biomarkører mod en specificitet på respektiv 47% og 63% for osteopontin COOH-fragmenter og glykosyleret EDN alene.

Identificerede ovariecancerbiomarkørers rolle i karcinogenesen

De identificerede biomarkører er enten akutte fasereaktanter, proteolytiske produkter eller faktorer associeret til inflammation, hvilket støtter teorien om inflammation som en vigtig komponent ved tumorprogression [30]. Teorien giver ikke forklaring på den sygdomsspecifikke proces i relation til proteinekspression ved cancersygdom [30]. Forhøjede niveauer af disse biomarkører er set ved andre cancertyper, hvilket øger interessen for de sygdomsspecifikke posttranslationelle modifikationer hos isoformer af markørerne. I undersøgelsen af Zhang et al er to af de tre biomarkører, TTR og ITIH4, fragmenter af det oprindelige protein. Der er ikke tidligere rapporteret om disse i forbindelse med proteomundersøgelser. TTR er i sin oprindelige form et transportmolekyle for serumtyroksin og trijodtyronin og faciliterer desuden transporten af retinol. TTR er identificeret i flere isoformer (Figur 3) og fundet i nedreguleret form ved andre sygdomstilstande end cancer og inflammatoriske tilstande [31]. Ud fra et prognostisk og fremtidsmæssigt perspektiv er det af interesse, at TTR-koncentrationen hos OC-patienter er omvendt proportional med tumorstørrelsen [32]. Det kløvede fragment af ITIH4, som Zhang identificerede, er forskelligt fra det fragment af ITIH4, som kløves af plasmakallikrein, hvilket tyder på, at forskellige proteaser er ansvarlige for proteinkløvning [33].

For at øge den diagnostiske specificitet er det nødvendigt med assays, som kan detektere og kvantificere de posttranslationelt modificerede former af de proteiner, som dannes ved et s ygdomsspecifikt lokalt host response i kroppen og efterfølgende indgår i den normale cirkulation. Fung et al har på baggrund af TTR- og ITIH4-resultaterne med serum fra bl.a. OC-patienter udviklet et SELDI-TOF-MS-baseret immunologisk og kromatografisk assay til detektion og kvantificering af proteinisoformer [34]. Metoden kræver detektion af yderligere multimarkørpaneler for at kunne bruges til måling af specifikke host response-proteiner.

Både ApoA1 og TTR er fundet i en nedreguleret form hos OC-patienter, hvorimod niveauet af ApoA1 ikke var ændret i serum hos bryst- og coloncancerpatienter. Niveauet af TTR var ikke ændret i serum fra bryst- og prostatacancerpatienter [27]. I et mindre studie, hvori serumlipidkoncentrationen hos kvinder med benigne og maligne ovarietumorer blev undersøgt, fandt man ligeledes en signifikant lavere koncentration af ApoA1 hos OC-patienter end hos raske kontrolpersoner [35].

Beta-Hb og TF, som blev identificeret af Kozak et al [28], indgår i henholdsvis oxygen- og jerntransporten i blodet. Det er tidligere foreslået, at en biokemisk modifikation af erytrocytmembranen hos kvinder med OC øger muligheden for hæmolyse [36], hvilket medfører en opregulering af beta-Hb hos OC-patienter. Ovenstående forklarer ikke, hvorfor beta-Hb og ikke andre Hb-former er opreguleret, ligesom det ikke forklarer noget om modifikation af erytrocytmembranen ved andre cancerformer. TF er en akut fasereaktant og er, i lighed med Kozak et al's resultater, tidligere rapporteret at falde i koncentration hos OC-patienter [37].

Den specifikke funktion af de identificerede OC-biomarkører i urin er endnu ukendt. EDN har blandt andet vist sig at have antitumoraktivitet og antiangiogenetisk aktivitet [38], og serumniveauet af osteopontin er forhøjet ved andre cancertyper [39], om end funktionen af isoformen med det COOH-terminal kløvede fragment, som blev fundet af Ye et al, er ukendt.

Konklusion

I forhold til serum CA125 alene og serum CA125 i kombination med ultralydundersøgelse har paneler af proteombiomarkører i henholdsvis serum og urin en højere sensitivitet og specificitet ved tidlige stadier af OC (Tabel 1). Trods lovende resultater og enighed om proteomteknologiens fremtidige muligheder fra internationalt førende videnskabelige tidsskrifter synes der at være store udfordringer, som skal overvindes, før metoden kan bruges som rutineredskab til diagnosticering og screening af OC-patienter.

Proteomet er, modsat genomet, under konstant dynamisk forandring i form af proteinekspression. Der kræves større viden om cellesignalering hos både syge og raske personer for at få kendskab til de sygdomsspecifikke proteiner. Biobanker med materiale fra raske kvinder, som senere får OC, kan i fremtiden bruges til detektion af biomarkører med høj sensitivitet for præklinisk sygdom. For at kunne omsætte proteomteknologiens muligheder til brugbare diagnostiske test, behøves større prospektive studier med blindede og uafhængige valideringer samt identifikation af yderligere OC-biomarkører. Set i lyset af kritikken af Petricoin et al's studium [14] er studiedesignet, herunder udvælgelse af korrekt risikopopulation, en udfordring i sig selv. Studierne af Zang, Kozak og Ye et al mangler eksempelvis en uddybende beskrivelse af deres raske kontrolgrupper [27-29] og bedre aldersmatchede kontrolgrupper [27, 28].

Jacobs & Menon har konkluderet, at en anvendelig screeningstest for OC kræver en specificitet på minimum 99,6% [40]. Skal dette mål nås, kræver det formentlig, at flere forskellige bioteknologier kombineres, og at man udnytter al tilgængelig bioinformation om OC.

Anette Lykke Petri, Gynækologisk Klinik 4232, Rigshospitalet, DK-2100 København Ø. E-mail: alpetri@dadlnet.dk

Antaget: 21. november 2006

Interessekonflikter: Estrid Høgdall, Claus Høgdall, Svend Aage Engelholm og Anette Lykke Petri er henholdsvis deltagere i og ph.d.-studerende ved det danske Pelvic Mass-studium som er implementeret på Rigshospitalet. Projektet har samarbejde med Ciphergen Biosystems Inc. (SELDI-TOF-MS) og Statens Serum Institut (MALDI-TOF-MS). Pelvic Mass-projektet modtager økonomisk støtte fra Ciphergen Biosystems Inc

1. Kjaerbye-Thygesen A, Huusom LD, Frederiksen K et al. Trends in the incidence and mortality of ovarian cancer in Denmark 1978-2002 - comparison with other Nordic Countries. Acta Obst Gyn Scand 2005;84:1006-12.
2. Ozols RF, Rubin SC, Thomas GM et al. Epithelial ovarian cancer. I: Hoskins WJ, Perez CA, Young RC, red. Principles and practice of gynaecologic oncology. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2000:981-1058.
3. Benedet JL, Pecorelli S. Staging classifications and clinical practice guidelines of gynaecologic cancers. The International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO). Int J Gyn Obst 2000;70:207-312.
4. Menon U. Ovarian cancer screening. Oncology 2004;171:323-24.
5. Jacobs IJ, Skates SJ, MacDonald N, et al. Screening for ovarian cancer: a pilot randomised controlled trial. Lancet 1999;353:1207-10.
6. Andersen ES, Knudsen A, Rix P et al. Risk of malignancy index in the preoperative evaluation of patients with adnexal masses. Gynecol Oncol 2003;90:109-12.
7. Giede KC, Kieser K, Dodge J et al. Who should operate on patients with ovarian cancer? Gyn Onco 2005;99:447-61.
8. Kræftplan II, Sundhedsstyrelsens anbefalinger til forbedringer af indsatsen på kræftområdet. København: Sundhedsstyrelsen, 2005.
9. Gorg A, Obermaier C, Boguth G, et al. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 2000;21:1037-53.
10. Fenne JB, Mann M, Meng CK et al. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science 1989;246:64-71.
11. James P. Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. Q Rev Biophys 1997;30:279-331.
12. Vorderwülbecke S, Cleverley S, Weinberger SR et al. Protein quantification by the SELDI-TOF-MS-based ProteinChip System. Nature Methods 2005;2:393-95.
13. Semmes OJ, Feng Z, Adam BL et al. Evaluation of serum protein profiling by surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for the detection of prostate cancer: I. Clin Chem 2005;51:102-12.
14. Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ova