Konfokal laserendomikroskopi er en lovende ny endoskopisk metode til diagnostik af kolorektal neoplasi og inflammatorisk tarmsygdom

Inden for de seneste år er konfokal laserendomikroskopi (CLE) blevet introduceret. Med denne teknik kan mikroskopiske strukturer i tarmens øverste lag vurderes in vivo i alle endoskopisk tilgængelige tarmafsnit under en endoskopisk undersøgelse. Teknikken er ligeledes ved at vinde indpas i andre specialer såsom urologi og pulmonologi. Anvendelsesmulighederne kommer formentlig i fremtiden til at krydse endnu flere specialegrænser. Da vores erfaringer knytter sig til neoplasier og inflammatorisk tarmsygdom (IBD) i den nedre gastrointestinalkanal, vil vi i denne artikel fokusere på kolorektal cancer, polypper og IBD. Hensigten er at beskrive CLE-teknikken, redegøre for anvendelsesmulighederne og evaluere de foreløbige resultater ift. ovenstående for en ny teknik i hastig udvikling.

KONFOKAL LASERENDOMIKROSKOPI

– TEKNIK OG KONTRASTMIDLER

Den tekniske opbygning

CLE er en kombination af et almindeligt endoskop, en laserenhed og et konfokalt mikroskop. Ved metoden benytter man sig af blåt laserlys, der med en bølgelængde på 488 nm fokuseres på mucosa i et lille område og i en prædefineret dybde på 0-250 mikrometer. Via mikroskopet opfanges kun det reflekterede fokuserede lys, mens alt uden for fokus, og dermed støjskabende lys, frasorteres [1]. Resultatet bliver et forstørret billede af mucosa i høj opløsning – en »optisk« eller »virtuel« biopsi, som kan sammenlignes med et tilsvarende mikroskopisk billede (Figur 1 og Figur 2). Billedet lagres digitalt, så det også efterfølgende kan vurderes. Ved CLE tages der multiple billeder i sekundet, og de lagres kontinuerligt, hvorved der dannes en filmsekvens, således at den mikroskopiske vurdering af vævet bliver dynamisk.

Der findes i øjeblikket to CLE-systemer på markedet: 1) Et endoskopbaseret system (Pentax EC 3870CIFK, Pentax, Tokyo, Japan), hvor det konfokale mikroskop udgør en integreret del af endoskopets spids. Med det kan man fremstille et mucosabillede med et areal på 500 × 500 mikrometer, en variabel dybde på 0-250 mikrometer og en opløsning på otte mikrometer [2]. Erfaringsmæssigt er billedkvaliteten ved dette system den bedste. 2) Et probebaseret system (Cellvizio, Mauna Kea Technologies, Paris, France), der modsat det endoskopbaserede har en fikseret dybde. De enkelte prober har en dybde, som passer til det organ, der ønskes undersøgt. Dybden kan variere mellem 55 mikrometer og 130 mikrometer afhængigt af proben. Systemet kan ved behov appliceres via endoskopets instrumentkanal under den endoskopiske procedure. Dette har udvidet indikationsområdet til også at involvere galdeveje og ductus pancreaticus [3]. Proberne har en begrænset levetid, idet de kun kan anvendes 20 gange, og de optager en af endoskopets arbejdskanaler [4].

Kontrastmidler

I forbindelse med CLE-undersøgelsen er det nødvendigt at forstærke vævets egen autofluorescens, hvorfor man benytter sig af et fluorescerende kontraststof. I dag er kun fluorescein godkendt til systemisk brug. Fluorescein administreres intravenøst, én del bindes til albumin, og den frie del diffunderer ud i vævene inden for 10-20 sekunder, hvorefter vaskularisering og vævets arkitektur, fraset cellekerner, visualiseres [5]. Halveringstiden for fluorescein er 24 minutter, og stoffet persisterer i vævet i ca. 30 minutter [6]. Som alternativt til fluorescein eller som supplement kan man benytte acriflavin, som administreres topisk. Acriflavin bindes til DNA og RNA og farver cytoplasma og cellekerner [7].

Ud over farvning med de to ovenstående fluorescerende farvestoffer benyttes der i tiltagende grad supplerende farvninger med monoklonale antistoffer, som kan f.eks. bruges i forbindelse med monitorering af behandlingsrespons ved antiangiogen terapi.

KOLOREKTAL PATOLOGI

Kolorektal cancer

Kolorektal cancer er, efter lungecancer, den hyppigste cancersygdom i Skandinavien. I Danmark diagnosticeres der ca. 3.100 patienter om året med kolorektal cancer [8], og der er i de senere år set en stigning i antallet af patienter med coloncancer og et fald i antallet af patienter med rectumcancer, alt i alt udgør cancer recti nu omtrent 33% [8]. Mortaliteten er relateret til høj risiko for metastasering, hvorfor tidlig diagnosticering af cancer er afgørende for prognosen [9]. Indtil videre anses koloskopi med biopsi for at være guldstandard til diagnostik. Mens den normale slimhinde i colon ved CLE vil kunne ses med jævnt fordelte regelmæssige krypter, tydelige mucinproducerende celler og intakt cylinderepitel, vil slimhinden ved coloncancer fremstå med tab af krypter og bægerceller og med generel disorganisering i vævets arkitektur. Ofte vil det makroskopisk ikke være svært at skelne avanceret cancer fra raskt væv – anderledes forholder det sig med forstadierne til kolorektal cancer, hvor det er vanskeligt alene på baggrund af endoskopien at skelne mellem nonneoplastiske og neoplastiske forandringer.

Kolorektale polypper

Det formodes, at langt de fleste kolorektale cancere udvikles fra benigne polypper (adenomer) [8]. Små neoplastiske polypper overses nemt under den endoskopiske procedure [10]. Flere forskergrupper har inden for de seneste år undersøgt brugen af CLE ved kolorektale polypper og cancer [2, 11, 12]. De har fundet, at man ved brug af CLE kan målrette sine biopsier og derved i højere grad opdage intraepiteliale neoplasier, end det er muligt ved konventionel koloskopi med biopsi [3, 9]. I et studie har man sammenlignet histopatologi og CLE-billeder af 116 polypper hos 72 patienter – som evaluering af metodens anvendelighed til differentiering mellem neoplastiske og nonneoplastiske forandringer – og fundet en sensitivitet på 97,3% og en specificitet på 92,8% [10].

Således er man under koloskopien i stand til med stor sikkerhed at afgøre, om polyppen skal fjernes eller ej.

Der findes endnu ikke noget standardiseret system til inddeling af dysplasigraden af kolorektale

polypper ved eCLE. Typisk bruges Mainzkriterierne, som i 2004 blev udviklet af Kiesslich et al. Her skelner man mellem neoplastiske og nonneoplastiske læsioner afhængigt af krypternes og karrenes arkitektur, ved at underinddele dem i tre kategorier: normalt,

regenerativt eller dysplastisk [12] (Tabel 1). Tilsvarende findes der for pCLE-teknikken et Miamiklassifikationssystem [13].

Inflammatorisk tarmsygdom

Ved at anvende CLE i vurderingen af patienter med mb. Crohn og colitis ulcerosa kan der påvises en barrieredysfunktion i den terminale ileum, hvor der i forhold til hos raske kontrolpersoner ses længere afstand mellem de enkelte epitelceller [14]. Endvidere kan man ved CLE identificere afstødning af epitelceller og lækage af fluorescein som udtryk for defekt endotel. Hos patienter i remission udgør disse fund en selvstændig risikofaktor for tilbagefald inden for et år [15]. En anden implikation på defekt barrierefunktion er, at der ved CLE identificeres flere bakterier i mucosa hos patienter med mb. Crohn og ulcerøs kolitis end hos raske kontrolpersoner [16].

ANGIOGENESE

Da man ved CLE er i stand til også at visualisere den øverste del af submucosa, kan man også visualisere kar og celler i dette lag ved hjælp af metoden. Angiogenese finder sted både under normale fysiologiske forhold og i forbindelse med cancer. Væv kan ikke forsynes tilstrækkeligt med O2 og næringssubstanser ved simpel diffusion ud over et par mm. Tumorvæv secernerer derfor substanser, heriblandt vaskular endotelial vækstfaktor [17], der fremmer angiogenesen. Modsat normale kapillærer er tumorinducerede, nye kar irregulære og utætte, jf. Mainzkriterierne. Intravenøst administreret fluorescein diffunderer derfor ud af kapillærerne og fordeler sig i det omgivende væv. Netop dette fænomen kan sammen med den irregulære kapillæropbygning visualiseres ved CLE [11]. Der forskes p.t. i brugen af CLE ved tumorvækst og angiogenese blandt andet i forbindelse med monitorering af behandlingsrespons ved antiangiogen terapi [11]. En anden angiogen faktor, som er øget i forbindelse med tumorvækst, er det transmembrane glykoprotein CD31. Der forskes p.t. i tråd med ovenstående i at påvise disse proteiner med anti-CD31-antistoffer farvet med fluorescens [18].

FORDELE OG ULEMPER

Fordelene ved CLE er allerede nævnt: Meget tyder på, at patienten kan få sin diagnose under endoskopien og dermed komme hurtigt i gang med relevante tiltag, f.eks. relevant medikamentel behandling ved IBD eller umiddelbar resektion af en neoplastisk polyp. Dette vil i nogle tilfælde kunne skåne patienten for en opfølgende endoskopi og dermed reducere risikoen for komplikationer samt spare tid for endoskopienheden [9]. Ulemperne er, at kun små områder af mucosa visualiseres ad gangen, hvorved proceduren bliver mere tidskrævende, især hvis større områder ønskes undersøgt. Metoden fordrer også, at patienten ligger helt stille. Vurderingen af de optiske biopsier vanskeliggøres ved blødning. Slutteligt er det påkrævet, at den enkelte endoskopør skal have et vist kendskab til histopatologi.

STATUS INTERNATIONALT OG I DANMARK

CLE er et udviklingsområde og indgår dermed endnu ikke som standardtilbud hverken i Danmark eller andre steder i verden. Der er tiltagende interesse for metoden internationalt, hvilket blandt andet kan ses ved et stigende antal publikationer. Endoskopienheden på Herlev Hospital har som den første i Danmark indført metoden. Der pågår i øjeblikket flere studier, som blandt andet skal belyse CLE’s rolle ved kolorektal cancer og hos patienter med IBD. CLE kan få en central plads i fremtidens endoskopiafsnit til at bedre diagnostik og monitorering af flere gastrointestinale sygdomme, målrette bioptering og spare tid for læger og patienter og herved danne grundlag for bedre behandlingsforløb.

Korrespondance: Marie Louise Malmstrøm, Kirurgisk Afdeling, Herlev Hospital, Herlev Ringvej 75, 2730 Herlev. E-mail: malmstroem@gmail.com

Antaget: 18. juli 2013

Publiceret på ugeskriftet.dk: 14. oktober 2013

Interessekonflikter:

Taksigelse: Pia Helene Klausen takkes for støtte og opbakning, og Tatiana Cartana takkes for lån af billeder.