Molekylærbiologisk diagnostik: maligne lymfoide tumorer hos voksne

Gennem det seneste årti er vores viden om molekylærbiologiske forandringer ved maligne lymfoproliferative sygdomme øget betydeligt. I lavmaligne lymfomer ses ofte defekt programmeret celledød, mens mere aggressive lymfoide tumorer tillige har andre genetiske forandringer i bl.a. de signalveje, der styrer celledeling og DNA-reparation. Genetisk analyse og analyse af genernes ekspressionsprofil kan anvendes i forbindelse med diagnostik og prognose og kan forhåbentlig i fremtiden også anvendes til at designe nye, biologisk målrettede behandlingsmodaliteter, som kan supplere eller helt erstatte den konventionelt anvendte kemoterapi.

Malignt lymfom og lymfocytær leukæmi er klonale sygdomme, som udgår fra lymfocytter eller lymfoide stamceller af B- eller T-celle-type. Sygdommene er heterogene og opdeles i mere end 40 forskellige undertyper (1). Denne detaljerede opdeling, som har stor betydning for prognose og valg af terapi, beror på en integreret vurdering af de maligne cellers morfologi, immunfænotype og genotype. I det følgende vil vi fokusere på de genetiske aspekter og give eksempler på forandringer, som både kan anvendes i forbindelse med diagnostik og behandling, og som kan belyse væsentlige aspekter vedrørende sygdommenes patogenese. Vi har valgt specielt at fokusere på maligne lymfoide tumorer hos voksne, da de molekylærbiologiske forandringer ved akut lymfoblastær leukæmi (ALL) - som er langt den hyppigste lymfoide malignitet hos børn - er velbeskrevet i en nyere statusartikel i Ugeskriftet (2).

Immunglobulin- og T-celle-receptor-generne

Lymfoide celler undergår en kontinuerlig modning fra den multipotente stamcelle til modne lymfocytter. Sideløbende hermed sker der et rearrangement af de gener, der koder for cellernes antigenreceptorer (1). I B-lymfocytter drejer det sig om immunglobulin (Ig)-generne og i T-lymfocytter om T-celle-receptor (TCR)-generne. Disse gener er homologe i opbygning og består af separate gensegmenter, som man kalder variable (V), diversity (D), joining (J) og konstante (C) gener. I ikkelymfatiske celler bibeholdes Ig- og TCR-generne i kimlinje (germline )-konfiguration, hvor de enkelte gener er adskilte af ikkekodende sekvenser. I lymfatiske celler sker der et rearrangement, hvor et V-, et D-, et J- og et C-segment udvælges, og de mellemliggende sekvenser klippes væk. Herefter opstår der somatiske mutationer i V-delen, som sikrer, at Ig eller TCR tilpasses optimalt til antigenet. Disse forandringer kan anvendes i diagnostisk sammenhæng, både til at afgøre, om et malignt lymfom er af B- eller T-celle-type og til at vurdere om et lymfoidt infiltrat er polyklonalt (og dermed sandsynligvis benignt) eller monoklonalt (og dermed sandsynligvis malignt) (3). Dette skyldes, at rearrangementet i et benignt (polyklonalt) infiltrat vil være forskelligt fra celle til celle, mens det vil være identisk i alle celler i et monoklonalt infiltrat. Undersøgelser af nukleotidsekvensen i IgV-generne kan belyse forekomsten af somatiske hypermutationer. Dette har klinisk betydning ved visse sygdomme, eksempelvis ved kronisk lymfatisk leukæmi af B-celle-typen (B-CLL), hvor man ved, at tilfælde uden somatiske mutationer i IgV-generne har et mere aggressivt forløb end tilfælde med somatiske IgV-mutationer i de maligne celler (4).

Malign lymfoproliferation, patogenetiske aspekter

Udviklingen af en malign tumor er betinget af en række komplekse, successive genetiske forandringer, som kan resultere i øget vækst og celledeling, nedsat programmeret celledød (apoptose) og defekt DNA-reparation. I normale celler er disse processer styret af en lang række proto-onkogener og tumorsuppressorgener. Maligne celler er karakteriserede ved aktivering af onkogener og inaktivering af tumorsuppressorgener. Dette sker f.eks. som følge af kromosomale translokationer, numeriske kromosomaberrationer, deletioner, genamplifikationer, punktmutationer og ved DNA-metylering. DNA-metyleringen ændrer ikke den kodende sekvens, men inaktiverer gentranskriptionen og adskiller sig fra de øvrige genetiske forandringer ved at være potentielt reversibel, idet de nedregulerede gener kan reaktiveres med stoffer, der fjerner metyleringen.

En forenklet fremstilling af nogle af de signalveje, som generne er impliceret i, er vist i Fig. 1 , mens Fig. 2 viser et eksempel på, hvorledes successivt erhvervede genetiske forandringer styrer transformationen fra en normal lymfocyt til et aggressivt lymfom. En oversigt over de væsentligste molekylære forandringer ved udvalgte maligne lymfoproliferative sygdomme er vist i Tabel 1 . Som det fremgår, er nogle ændringer specifikke for bestemte lymfomsygdomme og kan anvendes i diagnostisk sammenhæng. Dette gælder eksempelvis for mange af translokationerne. Andre forandringer forekommer ved mange forskellige typer af lymfom og er primært af interesse i prognostisk/behandlingsmæssig sammenhæng. Dette gælder for mange af de ændringer (deletioner, punktmutationer, metylering), som inaktiverer tumorsuppressorgenerne.

Opregulering af gener,
som fremmer vækst og celledeling

I B-celle-neoplasier opreguleres transkriptionen af mange proto-onkogener ved kromosomal translokation. Årsagen til disse forandringer er ukendt, men det er foreslået, at translokationerne kan være en følge af hypermutationsaktivitet i proto-onkogener som f.eks. BCL-6 og c-MYC (5). Disse mutationer vil oftest ikke ændre den kodende sekvens, men kan destabilisere genomet og forårsage brud på DNA'et, hvorved translokation muliggøres. Man antager, at sådanne onkogene hypermutationer opstår i forbindelse med en fejl i den fysiologiske hypermutation i IgV-generne (se ovenfor). I B-celle-tumorer flyttes onkogenet ofte til generne for Ig-tunge kæder (IgH) på kromosom 14, eller Ig-lette kæder (IgL) på kromosom 2 og 22. Herved kommer onkogenets ekspression under kontrol af de konstitutivt udtrykte immunglobulingeners transkriptionsapparat.

Eksempler på vigtige translokationer i B-celle-neoplasierne er t(8;14), t(2;8) og t(8;22) ved Burkitts lymfom (BL), der alle resulterer i opregulering af c-MYC (6), t(11;14) i mantelcellelymfomer (MCL) og myelomatose (MM), der fører til øget ekspression af cyclin D1, t(4;14) ved MM, der resulterer i opregulering af både FGFR3 og MMSET (7), og t(3;v) som aktiverer BCL-6 i diffust storcellet B-lymfom (DLBCL) og follik ulært lymfom (FL). Ved t(3;v) forstås, at BCL-6-genet på kromosom 3 ved translokationen kan fusionere med flere forskellige - variable (v) - partnergener. Ved en translokation kan der desuden kodes for et abnormt fusionsprotein, som typisk vil have øget aktivitet. Eksempel herpå er konstitutiv aktivering af tyrosinkinaserne BCR/ABL ved t(9;22) og NPM/ALK ved t(2;5). BCR/ABL-transkriptet er langt hyppigst ved kronisk myeloid leukæmi men forekommer ligeledes i 25% af ALL hos voksne (v-ALL) og er forbundet med dårlig prognose. NPM/ALK er patognomisk for storcellet anaplastisk T-celle-lymfom, hvor det er en favorabel prognostisk indikator (8). Alternative mekanismer til vækststimulering er aktiverende punktmutationer som f.eks. RAS-mutationer, som er forbundet med dårlig prognose i MM (7).

Nedregulering af væksthæmmende gener

Overgangen fra G1 til S-fase (»G1-checkpoint «) i cellecyklus styres af to overordnede tumorsuppressor-signalveje, p16-Rb samt ARF-TP53 (Fig. 1). Begge hæmmer cyclin/CDK-komplekser og kan derved blokere progression i cellecyklus. Ændringer i disse signalveje forekommer ved mange lymfoide tumorer og er typisk forbundet med et aggressivt forløb. Således er mutationer i TP53 forbundet med histologisk transformation i FL, MALT-type lymfomer og MCL (9), med dårlig prognose ved B-CLL og DLBCL og med relaps af v-ALL. p16-genet er inaktiveret ved metylering i en række tumorer, f.eks. DLBCL, MALT-type lymfomer, MCL, MM og BL. Deletioner af p16 vil i reglen også omfatte ARF , da disse to gener kodes fra samme område på genomet, og ved DLBCL er det vist, at patienter med defekter i både p16-Rb og ARF-TP53 har en langt dårligere prognose end patienter, som kun har defekt i en eller ingen af de to signalveje (10). Nyere studier tyder på, at andre gener, som regulerer cellecyklus, også kan agere som tumorsuppressorer i lymfoide tumorer. Således er CDK-inhibitoren p57 inaktiveret ved metylering i mange B-celle-tumorer, ligesom p15 og p73 hyppigt er inaktiveret ved metylering eller deletion ved v-ALL og er forbundet med dårlig prognose (11).

ATM molekylet (Fig. 1) overvåger integriteten af genomet, idet det ved brud på DNA'et inducerer cellecyklusarrest, DNA-reparation og apoptose. Som følge af de mange funktioner kan muterede celler akkumulere en række kromosomfejl, der tilsammen er betydende for, at ATM-muterede tumorer er særligt behandlingsresistente. ATM-genet er muteret i mange lymfoproliferative sygdomme, herunder DLBCL, MCL, B-CLL og T-celle-prolymfocytær leukæmi (12).

Defekter i apoptosegener

Apoptosen induceres via to overordnede signalveje (Fig. 1). Den eksterne aktiveres ved ekstracellulære signaler, mens den interne aktiveres af intracellulære stress-signaler (13). I det følgende gives der eksempler på, hvorledes disse signalveje er ødelagte i lymfomceller.

Den eksterne signalvej aktiveres bl.a. ved binding af Fas-liganden til Fas-receptoren på lymfocyttens overflade, og dette aktiverer en kaskadereaktion, der fører til, at cellen går i apoptose. Langt størstedelen af B-celle-tumorer er resistente over for stimulation af Fas. Dette kan skyldes, at Fas-receptoren er defekt (mutation) eller ikke er udtrykt (deletion eller manglede transkription). Endelig kan der være defekter i molekyler længere nede i kaskaden (caspaserne) som gør, at apoptosen ikke effektueres. Fas-muterede lymfomer er ofte ekstranodale og er hyppigt relaterede til forudgående autoimmun sygdom (14).

I langt de fleste FL samt i en relativt stor del af DLBCL hæmmes den interne signalvej ved overekspression af det antiapoptotiske BCL-2-gen ved t(14;18). BCL-2 blokerer apoptose ved at hæmme frigivelsen af cytocrom c fra mitokondrier, og dermed hindres aktivering af caspaser. p53 kan inducere apoptose via denne signalvej og kobler således cellecyklusarrest til apoptose. Inaktivering af TP53 kan derfor også hæmme apoptosen.

Begge signalveje kan desuden inhiberes af en gruppe proteiner, som blokerer caspaserne i den terminale del af den apoptotiske kaskade. Det drejer sig bl.a. om survivin og c-IAP2. Survivin er overudtrykt i en række lymfomer, og er en negativ prognostisk faktor ved DLBCL (15). Ved translokation t(11;18), hvor c-API-2 associerer med MLT1-genet, dannes et onkogent fusionsprotein, som er patognomisk for lavmaligne MALT-type lymfomer i ventriklen. Sådanne t(11;18) positive gastriske MALT-type lymfomer adskiller sig fra andre MALT-type lymfomer ved ikke at respondere på antibiotisk erradikation af Helicobacter pylori og ikke at transformere til højmaligne DLBCL (16). MLT1-genet kan imidlertid også translokeres til IgH-generne (t(14;18)). Sådanne translokationer er udelukkende påvist i t(11;18) negative MALT-type lymfomer lokaliseret udenfor ventriklen (i f.eks. spytkirtel, lever og hud) (17).

Genekspressionsprofilering med cDNA-»arrays«

De fleste af de gener, der er involverede i maligne lymfoproliferative sygdomme, styrer vigtige signalveje, og når de muterer, sker der formentlig vidtgående forandringer i ekspressionen af mRNA og protein i de maligne celler. Indtil for nylig har det ikke været muligt at foretage en detaljeret bestemmelse af disse globale ændringer i ekspressionen af mRNA. Kortlægningen af det humane genom og udviklingen af metoder til bestemmelse af mRNA ekspressionsprofilen med cDNA-arrays har nu gjort det muligt at bestemme ekspressionen af størstedelen af det humane genom i en enkelt analyse. Inden for de maligne hæmatologiske sygdomme er det vist, at denne teknik både kan anvendes til at skelne mellem akutte leukæmier af lymfoblastær og myeloid subtype (18), mellem forskellige perifere B- og T-celle-neoplasier (19) og mellem kendte prognostiske undergrupper af lymfom og lymfocytær leukæmi. Der er endvidere præliminære resultater, der tyder på, at teknikken også kan anvendes til at identificere nye prognostiske grupper inden for lymfomsygdomme, som er ens efter gængse morfologiske og immunfænotypiske kriterier. Dette gælder eksempelvis DLBCL og MM, som kan opdeles i forskellige prognostiske grupper baseret på ekspressionsprofilen bestemt med cDNA-arrays (19-22). Dette tyder på, at nogle, tilsyneladende ens, lymfoproliferative sygdomme er heterogene i både biologisk og klinisk sammenhæng, formentlig som udtryk for, at de maligne celler enten er histogenetisk forskellige eller har været udsat for forskellige intra- og/eller ekstracellulære påvirkninger under onkogenesen. Selv om der er mange metodologiske faktorer, som gør, at sådanne undersøgelser endnu ikke kan overføres direkte til klinikken, er perspektiverne interessante, og der er formentlig tale om en teknik, som vil få stor betydning for diagnostik og behandling af lymfompatienter i fremtiden.

Metodemæssige overvejelser

Der findes mange forskellige metoder til undersøgelse af ændringer i arvematerialet, herunder bl.a. metafasecytogenetik, interfase-fluorescence in situ-hybridisering (FISH) og forskellige polymerase chain reaction (PCR)-baserede metoder, hvor udgangsmaterialet enten kan være DNA eller RNA. Interfase FISH kan appliceres direkte på ufikserede udstrygnings- eller imprintpræparater. For de øvrige metoder gælder, at de i de fleste tilfælde kun kan anvendes på frisk, ufikseret materiale. Det må derfor tilrådes, at der nedfryses celler eller væv med henblik på senere genotypisk undersøgelse ved alle diagnostiske indgreb på patienter med - eller med formodet - malign lymfoproliferativ sygdom. Tilsvarende kan undersøgelse af genekspressionsprofilen kun udføres på mRNA, der er ekstraheret fra ufikseret materiale.

Konklusion og fremtidige perspektiver

Genetiske analyser anvendes i dag rutinemæssigt i forbindelse med diagnostik og behandling af patienter med malignt lymfom og lymfocytær leukæmi. Det er endnu relativt få teknikker, der anvendes i den daglige diagnostik. Det drejer især om undersøgelser af Ig- og TCR-generne og påvisning af de hyppigste translokationer. Disse undersøgelser kan anvendes til at skelne mellem benigne og maligne lymfatiske infiltrater og til at opdele de maligne i en lang række forskellige diagnostiske og prognostiske grupper. Ekspressionsprofilering og undersøgelser for punktmutationer, deletioner samt metylering betragtes stadig som mere eksperimentelle. Da disse metoder imidlertid giver vigtig information om forløb og prognose, er der grund til at tro, at de i nær fremtid vil indgå i den almindelige diagnostik som et vigtigt supplement til de mere konventionelle undersøgelser.

Et øget kendskab til de maligne cellers specifikke molekylære defekter vil formentlig ikke kun være en rettesnor for forløb og prognose, men kan forhåbentlig også danne baggrund for en individualiseret behandling. I analogi med anvendelsen af tyrosinkinasehæmmeren STI-571 ved BCR/ ABL-positive tilfælde af kronisk myeloid leukæmi og af demetylerende farmaka som 5-aza-2'-deoxycytidin (decitabin) ved myelodysplastisk syndrom, håber man at kunne udvikle stoffer som specifikt retter sig mod den tilgrundliggende genetiske defekt. Sådanne midler vil formentlig kunne supplere eller helt erstatte den konventionelt anvendte kemoterapi.

Kirsten Grønbæk , Institut for Biologisk Kræftforskning, Kræftens Bekæmpelse, Strandboulevarden 49, DK-2100 København Ø. E-mail: Kig@cancer.dk

Antaget den 27. januar 2003.

H:S Rigshospitalet, Patologisk Institut og Hæmatologisk Afdeling, og

Kræftens Bekæmpelse, København, Institut for Biologisk Kræftforskning.