Molekylærbiologiske aspekter af Marfansyndromer

Marfans syndrom (MFS) er en arvelig systemisk bindevævs-lidelse, hvis patogenese involverer transforming growth factor -β (TGF-β). Ekstracellulære strukturelle netværk af fibrillinrige mikrofibriller påvirker den lokale koncentration og frigivelse af signalmolekyler under morfogenese og vævsremodellering. Forstyrrelse i dette system kan forårsage MFS og MFS-lignende lidelser. I denne oversigt gennemgås litteraturen og herunder de data, der kan føre til et reelt behandlingstilbud til patienter med defekter i fibrillinsyntesen og en resulterende TGF-β-signa-lopati.

Marfans syndrom (MFS) er en arvelig systemisk bindevævslidelse, der første gang blev beskrevet af den franske børnelæge Antoine-Bernard Marfan i 1896 [1]. Cirka 50 år senere foreslog Victor McKusick , at MFS tilhørte en større gruppe af kongenitte sygdomme. Han klassificerede disse som arvelige bindevævslidelser, forårsaget af strukturel og metabolisk dysfunktion af ekstracellulære matrixproteiner [2].

I 1991 påviste Harry Dietz mutationer i fibrillin-1-genet (FBN1 ) hos patienter med MFS og bekræftede Victor McKusicks hypotese [3], om at sygdomspatogenesen involverer dannelse af strukturelt svagt bindevæv på grund af strukturelle forstyrrelser i bindevævets mikrofibriller [4, 5]. De nonvaskulære fund passede ikke utvunget med denne hypotese, og i senere studier har man fokuseret på andre sygdomsmekanismer, herunder involvering af transforming growth factor -β (TGF-β) [6-9].

I 2006 demonstrerede Harry Dietz , at mutationer i FBN1 forårsagede øget TGF-β-medieret signalering [1, 10, 11]. En øget signalering medførte dannelse og progression af aortaaneurismer i MFS-musemodeller, og blokering af TGF-β-signalering med anti-TGF-β-antistoffer stoppede progressionen af aortaaneurismet. Man gentog forsøgene med losartan - en selektiv angiotensin II-receptor-type 1 (AT1)-blokker og fandt den samme blokering i progressionen af aortaaneurismet [1, 10, 11]. Et enkelt nyligt studie har støttet dyreforsøgene [12], men flere kliniske forsøg med losartan versus betablokade afventes [13]. Med baggrund i dyrestudierne etableredes et nyt paradigme, hvor fibrillinrige og mikrofibrillære, ekstracellulære netværk bestemmer den lokale koncentration og frigivelse af TGF-β under morfogenese og vævsremodellering med en bred vifte af komplekse effekter på morfogenese og organfunktioner [1]. Forstyrrelse i dette system kan forårsage MFS og MFS-lignende lidelser, som derfor kunne kaldes TGF-β-signalopatier, og som belyses nærmere i denne oversigt. En klinisk gennemgang er behandlet i en anden artikel [14]. Under søgeordet Marfans syndrom på Pubmed fandtes 4.550 studier, og på Cochrane-review under samme søgeord blev der fundet 0 ud af 5.616 oversigter. For at reducere antallet af litteraturhenvisninger er der flere steder brugt oversigter.

Fibrillin-1-genet

Den grundlæggende patologi ved MFS blev traditionelt opfattet som en strukturel bindevævsdefekt med defekte elastiske fibre og en nedsat mængde elastin i MFS-patienters aorta og hud (Figur 1 ) [15]. Senere kunne koblingsanalyser på store Marfan-familier imidlertid vise kobling af Marfanlocus til kromosom 15, og det førte til identifikation af FBN1 . Studier viste, at en stor del af patienterne med MFS havde mutationer i FBN1 -genet, mens elastingenet ikke var involveret [16, 17]. FBN1 koder for fibrillin, og en defekt i dette protein medfører reduktion og ændret struktur af fibrillin i den ekstracellulære matrix. Konsekvensen er bindevævssvaghed med degeneration på steder, hvor der udøves stress på vævet, f.eks. af de pulsatile kræfter, der udøves på karvæggen i aorta ascendens [16, 17]. Mutationerne i FBN1 har en dominant effekt i overensstemmelse med den autosomal dominante arvegang af MFS i de fleste familier. Ved immunhistokemi ses en dramatisk reduktion i fibrillin hos de afficerede individer, der har en FBN1 -mutation [18, 19], hvilket peger på haploinsufficiens som FBN1 -mutationers hovedmekanisme. En dominant negativ effekt kan også være af betydning. Man mente længe, at det strukturelt abnorme fibrillin direkte ændrede biokemien i det ekstracellulære matrix, da det abnorme fibrillin dels førte til fibrillindestruktion, dels interfererede med mikrofibrillers aggregering og stabilitet [20, 21]. Nogle studier har vist, at patienter med præmature stopcodons i FBN1 har en mildere klinisk form af MFS [20, 21]. Sådanne præmature stopcodons vil føre til såkaldt nonsense -medieret messenger -ribonukleinsyre (mRNA)-decay med manglende dannelse af fibrillin fra den mutante allel (haploinsufficiens). Hos disse patienter optræder derfor ikke strukturelt abnormt fibrillin, hvilket måske kan forklare den mildere fænotype [22]. På baggrund af disse overvejelser har man forsøgt selektivt at destruere mutante alleller med formodet dominant negativ effekt for at opnå en haploinsufficiens i stedet. Dette har in vitro vist sig muligt ved anvendelsen af hammerhead ribozyme antisense technology, som kunne udgøre en mulig in vivo-terapi [23].

Judge et al foreslog, at overekspression i en muselinje af et mutant FBN1 -transgen på wild type -baggrund ville resultere i MFS-manifestationer på grund af den formodede dominant negative effekt af et mutant allel [24]. Imidlertid viste det sig, at flere muselinjer med robust ekspression af transgener med en FBN1-mutation, der var kendt for at give MFS, og to normale FBN1 -alleller ikke udviklede væsentlig aortasygdom. Muselinjer med sammenlignelige mutationer i et endogent FBN1 -allel udviklede klassisk MFS, som mildnedes, når der tilførtes et normalt FBN1 SPAN> -allel [24]. Der var altså effekt af antallet af allelkopier [24, 25]. Fundene støttes af observationer i nogle familier med høj intrafamiliær variation, hvor ekspressionsniveauet af det normale FBN1 -allel synes at korrelere omvendt proportionalt med alvorligheden af MFS [26].

Fibrillin-1-genet og transforming growth factor-β-aktivering og -signalering

Ud fra ovenstående studier kunne man ledes til at konkludere, at fibrillindefekten var central i patogenesen af MFS, men yderligere modificerende faktorer var sandsynlige (Figur 1). Man påviste, at Latent Transforming Growth Factor Beta (LTBPs) havde betydelige interaktioner med proteiner i den ekstracellulære matrix [27, 28]. TGF-β secerneres fra cellen som et Large Latent Complex (LLC), der indeholder det mature cytokin som en dimer kaldet Latent Associated Peptid e (LAP). LAP er et af de tre molekyler i LTBP. Mus med defekter i FBN1 har nedsat LAP og mangler evne til at tilbageholde LLC i den ekstracellulære matrix, hvilket medfører frigivelse af TGF-β og øget TGF-â-signalering [7]. Den ændrede TGF-β-signalering i mus med defekt FBN1 skyldes derfor øget frigivelse af TGF-â og aktivering af TGF-β-receptorer og ikke en øget produktion af TGF-β [7]. Ændringer i TGF-β-signalering kan forklare mange af de MFS-manifestationer, der ikke er en logisk følge af en strukturel defekt som følge af FBN1 -mutationer, herunder myksomatøse atrioventrikulære (AV)-klapper, overvækst af lange tubulære knogler og defekt kraniofacial morfogenese [7].

Den alvorligste og ofte livstruende manifestation hos MFS-patienter er som tidligere nævnt aortaaneurismer med eventuel dissektion. Traditionelt har -aortaaneurismer været opfattet som forårsaget af en strukturel svaghed i karvæggen som følge af en FBN1-mutation. Ovenstående TGF-β-studiers resultater peger på, at mutationer i FBN1 ikke alene har betydning for strukturen af den ekstracellulære matrix, men også ændrer TGF-β-aktivitet og signalering i aortas karvæg [10]. Således har heterozygote FBN1 -mutante mus med aortaaneurisme og patienter med MFS øget TGF-β-signalering i aorta [10, 29]. Hos mus - men ikke hos mennesker - kan behandling med neutraliserende TGF-β-antistoffer reducere størrelsen af aorta og forbedre strukturen af karvæggen [10].

Angiotensin II og transforming growth factor-β-aktivering og -signalering

Angiotensin II er relateret til TGF-β-aktivering og signalering [30]. Stimulering af TGF-β-receptorer medfører, at en familie af transskriptionsfaktorer (smads ) aktiveres [31] (Figur 1). I glatte muskelceller kan -angiotensin II også aktivere smads direkte og uafhængigt af TGF-β-ligander [32]. Behandling med angiotensinkonverterende enzym-hæmmere (ACE-hæm-mere) og angiotensin II-receptorblokkere (ARBs) er effektiv hos nyresyge med overskud af TGF-β, og dette styrker formodningen om, at patienter med andre lidelser, der er forårsaget af overskud af TGF-β kunne have gavn af en sådan behandling [33, 34]. De to receptorer for angiotensin II, type 1 (AT1) og type 2 (AT2) har modsat effekt på TGF-β-signalering. Daugherty rapporterede, at infusion med angiotensin II i apolipoprotein-E- (apoE-)-mus resulterede i udvikling af abdominalt aortaaneurisme [35]. Efterfølgende fandt man, at samtidig infusion af angiotensin II og losartan (en selektiv AT1-antagonist) forebyggede udvikling af aortaaneurisme hos musene [36]. Derimod accelereredes udviklingen af aneurismer hos mus, der fik angiotensin II og PD123319 - en selektiv AT2-antagonist [36]. Losartan blokerer specifikt AT1-receptorerne og modvirker ikke stimulation af AT2-receptorerne, hvilket synes at være en fordel ved forebyggelsen af aortaaneurismer. Behandling med ACE-hæmmere blokerer både AT1 og den beskyttende AT2-receptor og har ikke samme gunstige effekt [30].

Losartans evne til at forsinke og/eller forebygge aorta ascendens-aneurismer er blevet bekræftet i MFS-musemodeller [10]. Behandlingen blev initieret ved moderat proksimal dilatation af aorta ascendens og sammenlignet med propranolol (betablokker) i doseringer, som havde lignende hæmodynamiske -effekter. Mus, der blev behandlet med propranolol, viste en relativ reduktion i væksthastigheden af aortaroden sammenlignet med ubehandlede mus. Losar--tan reverserede den patologiske vækst af aortaroden [10], og normaliserede dertil aortavæggens tykkelse og strukturen, hvilket ikke sås hos de propranololbehandlede. Efter seks måneders losartanbehandling kunne mus med defekt FBN1 ikke adskilles fra wild-type -musene [10]. Forsøgene indikerer, at hæmning af TGF-β-signalering fører til en aktiv remodellering af aortavæggen. Under forsøgene fandt man også væsentlige pulmonære og skeletmuskelforbedringer, hvilket yderligere styrker konklusionen, at behandlingens effekt er relateret til nedsat TGF-β-signalering og ikke til en nedsættelse af det hæmodynamiske stress [10, 37]. Disse studier har naturligvis stor betydning for kommende terapeutiske strategier for patienter med MFS.

Genetik

Som det fremgår af ovenstående, forårsages klassisk MFS af mutationer i FBN1 og flere MFS-lignende sygdomme af mutationer i TGFBR1 og -2 [38]. Det er i dag muligt at teste for mutationer i disse gener, og der er beskrevet punktmutationer, insertioner/deletioner, splice site -mutationer, og andre komplekse rearrangementer i disse gener (Tabel 1 ). Faivre et al fandt i et klinisk studie af 1.013 patienter en korrelation mellem forskellige mutationstyper og kliniske manifestationer, der muligvis indikerer forskellige underliggende patofysiologiske mekanismer - både genetiske (dominant negative versus haploinsufficiens) og funktionelle (strukturel funktion af FBN1 versus mediator af TGF-β-signalering) [39]. De viste også, at mutation i exon 24-32 regionen var relateret til en dårlig prognose. Der kendes dog ikke mutationer hos alle med formodet MFS, og diagnosen er derfor fortsat primært klinisk. Detektionsraten for mutationer i FBN1, TGFBR1 og -2 er afhængig af flere forhold, herunder: Hvordan den kliniske selektion er foretaget; hvilken teknik, der er anvendt til undersøgelse af generne; samt formodede forandringer i andre gener, der koder for proteiner, der indgår i TGF-β-signaleringskaskaden. Følgelig kan fund af en mutation i FBN1, TGFBR1 og -2 bekræfte diagnosen, mens fravær af mutation i disse gener ikke vil kunne udelukke diagnosen.

Konklusion og perspektiv

Nylig forskning har revolutioneret indsigten i den molekylærgenetiske ætiologi og patogenese for MFS og lignende syndromer. Det nye paradigme, at matrix-sequestration regulerer den lokale aktivering af latent TGF-β, har medført vigtige nye muligheder for behandling. Ændring i TGF-β-signaleringen er nu et attraktivt farmakologisk angrebspunkt til at reducere progressionen i udviklingen af aneurismer. Involveringen af TGF-^ 6; i patogenesen for MFS hjælper til at forklare den kliniske variation med henvisning til de mange muligheder for modifikation af TGF-β signaleringen. Generne, der koder for TGF-β-regulatorer og -effektorer, er attraktive nye genkandidater for sygdomme med fænotypiske manifestationer, som overlapper med MFS, herunder Loeys-Dietz syndrom, hvor mutationer i TGFBR1- og TGFBR2 - allerede er beskrevet. MFS er ændret fra at være opfattet som forårsaget af en strukturel defekt i bindevævet til at være en lidelse, som via involvering af TGF-β-signalering har meget komplekse, herunder regulatoriske konsekvenser for morfogenese og funktionen af multiple organsystemer. Dette var ikke uventet ud fra den kliniske fænotype, og det underbygger værdien af koblingen mellem basal forskning og kliniske studier, som en fremtidig afdækning af andre, herunder behandlingsmæssige, facetter af disse meget komplicerede sygdomme vil afhænge af.

Tina Zimmermann Belsing , Kildegårdsvej 16 B, 2. tv., 2900 Hellerup.

E-mail: t.z.belsing@dadlnet.dk

Antaget: 5. maj 2009

Først på nettet: 6. september 2010

Interessekonflikter: Ingen

1. Ramirez F, Dietz HC. Marfan syndrome: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Curr Opin Genet Dev 2007;17:252-8.
2. McKusick VA. Heritable disorders of connective tissue. III. The Marfan syndrome. J Chronic Dis 1955;2:609-44.
3. Dietz HC, Cutting GR, Pyeritz RE et al. Marfan syndrome caused by a recurrent de novo missense mutation in the fibrillin gene. Nature 1991;352:337-9.
4. Aoyama T, Francke U, Dietz HC et al. Quantitative differences in biosynthesis and extracellular deposition of fibrillin in cultured fibroblasts distinguish five groups of Marfan syndrome patients and suggest distinct pathogenetic -mec-hanisms. J Clin Invest 1994;94:130-7.
5. Eldadah ZA, Brenn T, Furthmayr H et al. Expression of a mutant human fibrillin allele upon a normal human or murine genetic background recapitulates a Marfan cellular phenotype. J Clin Invest 1995;95:874-80.
6. Bunton TE, Biery NJ, Myers L et al. Phenotypic alteration of vascular smooth muscle cells precedes elastolysis in a mouse model of Marfan syndrome. Circ Res 2001;88:37-43.
7. Neptune ER, Frischmeyer PA, Arking DE et al. Dysregulation of TGF-beta acti-vation contributes to pathogenesis in Marfan syndrome. Nat Genet 2003;33:407-11.
8. Ng CM, Cheng A, Myers LA et al. TGF-beta-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. J Clin Invest 2004;114:1586-92.
9. Pereira L, Lee SY, Gayraud B et al. Pathogenetic sequence for aneurysm -rev-ealed in mice underexpressing fibrillin-1. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:3819-23.
10. Habashi JP, Judge DP, Holm TM et al. Losartan, an AT1 antagonist, prevents aortic aneurysm in a mouse model of Marfan syndrome. Science 2006;312:117-21.
11. Ramirez F, Dietz HC. Fibrillin-rich microfibrils: Structural determinants of mor-phogenetic and homeostatic events. J Cell Physiol 2007;213:326-30.
12. Brooke BS, Habashi JP, Judge DP et al. Angiotensin II blockade and aortic-root dilation in Marfan's syndrome. N Engl J Med 2008;358:2787-95.
13. Lacro RV, Dietz HC, Wruck LM et al. Rationale and design of a randomized clin-ical trial of beta-blocker therapy (atenolol) versus angiotensin II receptor blocker therapy (losartan) in individuals with Marfan syndrome. Am Heart J 2007;154:624-31.
14. Belzing TZ, Lund AM, Søndergaard L et al. Kliniske aspekter af Marfans syndrom. Ugeskr Læger 2011;173:337-42.
15. Halme T, Savunen T, Aho H et al. Elastin and collagen in the aortic wall: -changes in the Marfan syndrome and annuloaortic ectasia. Exp Mol Pathol 1985;43:1-12.
16. Dietz HC, Pyeritz RE, Hall BD et al. The Marfan syndrome locus: confirmation of assignment to chromosome 15 and identification of tightly linked markers at 15q15-q21.3. Genomics 1991;9:355-61.
17. Kainulainen K, Pulkkinen L, Savolainen A et al. Location on chromosome 15 of the gene defect causing Marfan syndrome. N Engl J Med 1990;323:935-9.
18. Hollister DW, Godfrey M, Sakai LY et al. Immunohistologic abnormalities of the microfibrillar-fiber system in the Marfan syndrome. N Engl J Med 1990;323:152-9.
19. Sakai LY, Keene DR, Engvall E. Fibrillin, a new 350-kD glycoprotein, is a com-ponent of extracellular microfibrils. J Cell Biol 1986;103:2499-509.
20. Dietz HC, McIntosh I, Sakai LY et al. Four novel FBN1 mutations: significance for mutant transcript level and EGF-like domain calcium binding in the pathogen-esis of Marfan syndrome. Genomics 1993;17:468-75.
21. Schrijver I, Liu W, Odom R et al. Premature termination mutations in FBN1: -dis-tinct effects on differential allelic expression and on protein and clinical phenotypes. Am J Hum Genet 2002;71:223-37.
22. Frischmeyer PA, Dietz HC. Nonsense-mediated mRNA decay in health and dis-ease. Hum Mol Genet 1999;8:1893-900.
23. Montgomery RA, Dietz HC. Inhibition of fibrillin 1 expression using U1 snRNA as a vehicle for the presentation of antisense targeting sequence. Hum Mol Genet 1997;6:519-25.
24. Judge DP, Biery NJ, Keene DR et al. Evidence for a critical contribution of haploinsufficiency in the complex pathogenesis of Marfan syndrome. J Clin Invest 2004;114:172-81.
25. Pereira L, D'Alessio M, Ramirez F et al. Genomic organization of the sequence coding for fibrillin, the defective gene product in Marfan syndrome. Hum Mol Genet 1993;2:961-8.
26. Hutchinson S, Furger A, Halliday D et al. Allelic variation in normal human FBN1 expression in a family with Marfan syndrome: a potential modifier of phenotype? Hum Mol Genet 2003;12:2269-76.
27. Isogai Z, Ono RN, Ushiro S et al. Latent transforming growth factor beta-binding protein 1 interacts with fibrillin and is a microfibril-associated protein. J Biol Chem 2003;278:2750-7.
28. Sinha S, Nevett C, Shuttleworth CA et al. Cellular and extracellular biology of the latent transforming growth factor-beta binding proteins. Matrix Biol 1998;17(8-9):529-45.
29. Loeys BL, Chen J, Neptune ER et al. A syndrome of altered cardiovascular, craniofacial, neurocognitive and skeletal development caused by mutations in TGFBR1 or TGFBR2. Nat Genet 2005;37:275-81.
30. Judge DP, Dietz HC. Therapy of Marfan syndrome. Annu Rev Med 2008;59:43-59.
31. Massague J, Seoane J, Wotton D. Smad transcription factors. Genes Dev 2005;19:2783-810.
32. Rodriguez-Vita J, Sanchez-Lopez E, Esteban V et al. Angiotensin II activates the Smad pathway in vascular smooth muscle cells by a transforming growth factor-beta-independent mechanism. Circulation 2005;111:2509-17.
33. Houlihan CA, Akdeniz A, Tsalamandris C et al. Urinary transforming growth factor-beta excretion in