Molekylære mekanismer bag den immunologiske reaktion mod gluten hos patienter med cøliaki

Cøliaki skyldes intolerance over for kosttilført hvedegluten og relaterede proteiner i rug og byg. Intolerancen forårsager en kronisk inflammation af tyndtarmens slimhinde. Inflammationen fører til villusatrofi og kryptcellehyperplasi af tarmmucosa, hvilket hindrer en effektiv optagelse af næringsstoffer med malabsorption til følge. Cøliaki er den eneste beskrevne sygdom med autoimmunt præg, hvor den eksterne trigger (gluten) er kendt, og en strengt glutenfri diæt medfører fuldstændig remission af sygdommen. Sygdommens forekomst og symptomer og diagnostikken, der er forbundet hermed, er for nylig gennemgået i Ugeskrift for Læger (1).

Inden for de seneste år har man identificeret peptider, der genkendes af CD4+ -T-celler, isoleret fra cøliakipatienters tarmbiopsier. Det er desuden fastslået, at en enzymkatalyseret modificering af disse peptider er essentiel for den binding til DQ2- eller DQ8-molekyler på antigenpræsenterende celler, der er nødvendig for at initiere et effektivt T-celle-respons. På denne baggrund er der etableret en molekylær model af den velkendte association mellem cøliaki og forekomsten af vævstypeantigenerne DQ2 og DQ8. Denne statusartikel fokuserer på ny viden om samspillet mellem genetiske og miljømæssige faktorer samt de cellulære og molekylære processer, der fører til udviklingen af cøliaki.

Genetik

Risikoen for at søskende til en cøliakipatient får sygdommen er 20-60 gange højere end hos den normale befolkning, hvilket understreger betydningen af genetiske faktorer. Tvillingestudier understøtter dette, idet konkordansraten for sygdomsforekomst er ca. 70% hos monozygotiske tvillinger mod ca. 20% hos dizygotiske tvillinger.

Omkring 95% af de kaukaside cøliakipatienter bærer vævstypemolekylet HLA-DQ2 (DQA1*0501/DQB1*0201) og med meget få undtagelser findes HLA-DQ8 (DQA1*0301/DQB1*0302) hos de resterende patienter. De fleste patienter har haplotypen DR3-DQ2 (DRB1*0301;-DQA1*0501;DQB1*0201) eller de er DR5-DQ7- og DR7-DQ2-heterozygote (Fig. 1 ). Hos de få HLA-DQ2-negative cøliakipatienter findes næsten uden undtagelse HLA-DQ8 (DQA1*0301;DQB1*0302).

Major histocompatibility complex (MHC)-associationen forklarer imidlertid ikke mere end ca. 40% af den familiære risiko for at udvikle cøliaki, og konkordansraten for cøliaki mellem HLA-identiske søskende er kun ca. 30%. Sammenholdt med at 25-30% af normalbefolkningen bærer ovenstående allelkombinationer uden at få sygdommen, betyder det, at non-HLA-loci har afgørende betydning for den genetiske prædisposition. Trods flere familiebaserede associations- og koblingsstudier af det humane genom, er det endnu ikke lykkedes at identificere mere end et fåtal non-HLA loci, der bidrager til den genetiske disposition for cøliaki. Dette tyder på, at de ukendte prædisponerende gener hver især kun bidrager i begrænset omfang til den totale genetiske risiko for at komme til at lide af sygdommen. Visse allele varianter (polymorfier) af genet for CTLA-4 (cytotoksisk T-lymfocytassocieret antigen 4) synes at bidrage til den genetiske disposition for cøliaki. Derudover er der fundet (svag) kobling til kandidatregioner på de kromosomale loci 2q, 5q og 11 q. Der er dog fundet demografiske forskelle i bl.a. koblingen til CTLA-4-genet, hvilket tyder på, at cøliaki har en kompleks genetisk baggrund. Komplekse genetiske sygdomme udviser ofte locusheterogenitet, således at forskellige gener producerer sygdom i forskellige familier, gener interagerer med hinanden, og forskellige kombinationer af genvarianter fører til den samme fænotype. Dette vanskeliggør naturligvis identifikationen af gener, der prædisponerer for sygdommen.

T-celle-genkendelse af deamiderede glutenpeptider

Glutenreaktive T-celler findes hyppigt i tyndtarmsbiopsier fra cøliakipatienter, men ikke hos kontrolpersoner. Disse T-celler er CD4+ , benytter αβ -receptortypen og er primært af Th1-fænotypen. Ex vivo-studier af tyndtarmsbiopsier fra cøliakipatienter har afsløret, at disse T-celler uden undtagelse responderer på peptider fra gluten, præsenteret af de sygdomsassocierede HLA-DQ2- og -DQ8-molekyler (3).

Gluten indeholder proteinfraktionen prolamin, og i hvede er det prolaminfraktionen gliadin, der indeholder det toksiske protein. De immunreaktive proteiner i cøliaki er α - og γ -gliadin og disse indeholder i deres oprindelige form meget få negativt ladede aminosyrer. Derfor har uændrede peptider udledt af gliadin ikke en tilstrækkelig høj bindingsaffinitet til HLA-DQ2-molekylet til at sikre de stabile peptid-DQ2-komplekser, der er nødvendige for at initiere et effektivt T-hjælpercelle-respons. Gliadin indeholder imidlertid mange neutrale glutamin (Q)-aminosyrer (omkring 40% af peptidet), der ved deamidering til den negativt ladede aminosyre-glutaminsyre (E) på bestemte steder af peptidet øger bindingen til HLA-DQ2. En sådan deamidering kan finde sted i tarmens miljø, men alternativt kan deamideringen medieres af det Ca2+ -afhængige enzym vævstransglutaminase (tTG), hvis aktivitet er forhøjet i tyndtarmsslimhinden hos cøliakipatienter. Ud over at mediere deamidering af Q har tTG en vigtig funktion i heling af vævsskader, samling af ektracellulærmatrix og sammenvoksning af celler via katalyse af krydsbindinger (transamidering) mellem Q-donor og Q-acceptor-proteiner (f.eks. fibronektin).

I løbet af de senere år er der identificeret peptider, der er udledt af gliadin og genkendt af DQ2-restringerede CD4+ T-celler isoleret fra tarmbiopsier af cøliakipatienter. Stimuleringen af T-cellerne til proliferation kræver udskiftning af enkelte Q-aminosyrer med E på bestemte ankerpositioner (4). Denne deamidering katalyseres af tTG in vivo.

Der optræder en markant ophobning af DQ2-restringerede T-celle-epitoper i de regioner af α - og γ -gliadin, der har den højeste forekomst af aminosyren prolin (P). P spiller en central rolle for disse epitopers immunogenicitet, hvilket kan skyldes flere faktorer: 1) fordøjede T-celle-antigener er normalt sjældne, idet kosttilførte proteiner oftest nedbrydes under fordøjelsen til peptidfragmenter, der er mindre end den minimumslængde på ni aminosyrer, der kræves for at initiere et T-celle-respons (gælder MHC I-præsentation, mens MHC II-præsentation, fx via DQ2, kræver endnu længere peptider); 2) P beskytter peptider mod proteolytisk nedbrydning, hvilket medfører, at de P-rige regioner af gliadinpeptiderne når tyndtarmens lamina propria i store fragmenter. Desuden har den indbyrdes afstand mellem Q og P helt afgørende betydning for tTG's specificitet. Den foretrukne afstand mellem Q og P forekommer ofte i de regioner, hvor epitoperne er ophobet, og de mange Q-aminosyrer i disse P-rige omgivelser er et glimrende substrat for tTG.

Helt ny forskning har medført identifikation af et 33-mer peptidfragment af α -gliadin, der tilsyneladende er den primære igangsætter af den inflammatoriske respons mod gluten i cøliakipatienter (Fig. 2 ) (5). Peptid-fragmentet reagerer med tTG med markant højere affinitet end noget kendt naturligt tTG substrat. Peptidfragmentet indeholder tre gentagne og overlappende (oligomeriserede) unikke T-celle-epitoper, der henholdsvis er til stede tre gange, to gange og en gang og derved kan fungere som et multivalent tTG-substrat. Herudover understreges peptidfragmentets centrale rolle i patogenesen ved cøliaki af, at peptidfragmentet er en meget potent stimulator af tre forskellige DQ2-restringerede T-celle-kloner og alle undersøgte T-celle-linjer isoleret fra tyndtarmsbiopsier fra cøliakipatienter. 33-mer peptid-fragmentet er modstandsdygtigt mod alle mave-, pancreas- og tarm-børstesøm-proteaser, hvilket sandsynliggør, at peptidfragmentet kan trænge ind i tyndtarmens lamina propria hos cøliakipatienter. Til gengæld nedbrydes peptidet effektivt af visse bakterielle endopeptidaser.

Homologer til dette 33-mer peptidfragment er udelukkende fundet i de kornsorter (hvede, rug og byg), der er inflammationsinitierende hos cøliakipatienter. Dette forklarer med stor sandsynlighed, hvorfor cøliakipatienter udelukkende er intolerante over for proteiner fra disse kornsorter og ikke andre hyppigt forekommende kosttilførte proteiner.

Mekanismer involveret i dannelsen af cøliakilæsionen

Et karakteristisk træk ved cøliaki er en forøget permeabilitet af tyndtarmens slimhinde. De tidlige hændelser, der fører til denne nedsættelse af slimhindetætheden, er stort set ukendte, men menes at være initieret af en tarminfektion eller en mekanisk/kemisk skade af tyndtarmen (6). Ekspressionen af proteinet zonulin, en modulator af permeabiliteten af tight junctions i tarmen, er unormalt forøget i tarmbiopsier fra cøliakipatienter. Efter binding til en specifik overfladereceptor og via en kaskade af intracellulære signaleringer, menes zonulin at katalysere en proteinkinase C-afhængig polymerisering af aktin mikrofilamenter, der fører til »åbning« af tight junctions i tarmepitelet. Zonulin medvirker dermed sandsynligvis til en rumlig forøgelse af de paracellulære pathways og dermed en øget permeabilitet af tyndtarmsslimhinden. Herefter kan proteinfragmenter bl.a. fra gliadin (herunder det omtalte 33-mer peptidfragment) trænge ind i lamina propria.

En vævsskade medfører frigivelse af tTG fra intracellulære depoter, hvorefter den omtalte deamidering af Q-aminosyrer i gliadinpeptider kan finde sted. Den efterfølgende CD4+ -T-celle-aktivering igangsætter en kaskade af begivenheder, der fører til villusatrofi og krypthyperplasi.

T-cellerne syntetiserer store mængder af inflammatoriske mediatorer (cytokiner), der direkte og indirekte er medvirkende til den inflammatoriske proces. Således udskiller lamina propria T-lymfocytter, der er isoleret fra inflammeret tarmvæv fra cøliakipatienter, spontant store mængder interferon (IFN)-γ mRNA in vitro. IFN-γ kan aktivere makrofager og udskillelsen af proinflammatoriske cytokiner, som interleukin (IL)-1, IL-6 og tumour necrosis factor (TNF)-α , der opretholder og øger det lokale inflammatoriske respons. Samtidig er der en ukontrolleret høj udskillelse af IL-15 (7). Dette cytokin fremmer ekspressionen af det antiapoptotiske protein Bcl-2, hvilket gør T-cellerne modstandsdygtige over for apoptose.

I forsøg med dyr og med føtale tarmvævskulturer har man vist, at IL-2, TNF-α , IFN-γ og IFN-α /β fører til ændringer af tyndtarmsslimhinden, der minder om ændringerne ved cøliaki. Mekanismen indebærer bl.a. dannelsen af matrixmetalloproteinaser (MMP), som nedbryder kollagener i den ekstracellulære matrix. Den hurtige nedbrydning af villi, der foregår få timer efter gliadinprovokation af cøliakipatienter, skyldes sandsynligvis netop en nedbrydning af tarmkollagener.

I museforsøg kan gliadinfragmenter have en direkte stimulerende effekt på makrofager uden involvering af T-celler og tTG. Gluten, gliadin og deres proteolytiske fragmenter forøger produktionen og udskillelsen af den potente inflammatoriske mediator NO (nitrogen monooxid), TNF-α og IL-10 fra peritoneale musemakrofager, når de tilføres sammen med IFN-γ . Det aktive gliadinfragment (VSFQQPQQQYPSSQ) findes i den primære sekvens af α 2-gliadin (7).

I modsætning til hos raske kontrolpersoner, er der en høj ekspression af NO-syntetase i tyndtarmen hos patienter med cøliaki, ligesom man finder forhøjede niveauer af NO i urin og plasma.

In vitro kan hele den omtalte inflammatoriske kaskade inklusive nedbrydningen af tarmvævets struktur tilsyneladende initieres af IFN-α alene. Sammenholdt med den kliniske observation, at patienter i behandling med IFN-α ikke helt sjældent udvikler symptomatisk cøliaki, peger det på en central rolle for IFN-α . IFN-α er en tidlig og vigtig del af det antivirale immunologiske respons. Dette peger igen på (virus)infektion som en mulig udløsende faktor for sygdommen.

Koincidens med autoimmunsygdomme

Cøliaki optræder ofte sammen med autoimmunsygdomme og der er observeret en 10-30 gange højere end forventet forekomst af asymptomatisk cøliaki hos både børn og voksne med autoimmune lidelser såsom type 1-diabetes mellitus, autoimmun thyreoiditis og Sjögrens syndrom. Denne hyppige koincidens af autoimmunsygdomme kunne forklares ved en fælles genetisk baggrund eller ved at én autoimmun sygdom har patogene konsekvenser for en eller flere andre. Omvendt ses en forøget forekomst af andre autoimmunsygdomme hos patienter med ubehandlet cøliaki. Risikoen øges med varigheden af gluteneksposition, hvorfor tidlig diagnosticering af cøliaki og efterfølgende glutenfri diæt muligvis kan reducere udviklingen af andre autoimmunsygdomme.

Som omtalt katalyserer enzymet tTG dannelsen af irreversible krydsbindinger mellem glutamindonor- og glutaminacceptor-proteiner. Gliadin er et af de få glutaminrige proteiner, hvorimod en lang række forskelle proteiner kan fungere som glutaminacceptorer, hvilket kan føre til dannelsen af forskellige gliadinglutaminacceptorkomplekser. Disse komplekser kan virke antigene, og hos patienter med cøliaki findes ofte en høj titer af antistoffer mod sådanne neoepitoper.

Autoantistoffer mod tTG hos cøliakipatienter kan binde tTG og muligvis inaktivere enzymets fysiologiske funktion, så bestemte vævsspecifikke proteiner ikke modificeres af tTG på normal vis. Dette kan hypotetisk fø re til dannelsen af peptider, som af MHC klasse II-molekyler præsenteres for immunsystemet som autoantigener/epitoper.

Perspektiver

Den øgede forståelse af de molekylære mekanismer bag cøliakisygdommens patogenese åbner for interessante terapeutiske perspektiver. Den nærmest totale afhængighed af forekomsten af vævstypemolekylerne DQ2 eller DQ8 gør det relevant at spekulere i en blokering af disse, fx med ikkeaktiverende peptidomimetika. Identifikationen af bakterielle proteolytiske enzymer, der kan nedbryde den ellers proteolyseresistente 33-mer, giver potentielt mulighed for »detoksifikation«, ex vivo eller in vivo, af kosttilført gluten. Pga. det nu kendte antigen kan cøliaki udgøre en model for fortsat udforskning af autoimmunitet.

Christian Nielsen , Klinisk Immunologisk Afdeling, Odense Universitetshospital, DK-5000 Odense C.

Antaget den 15. januar 2003.

Odense Universitetshospital, Klinisk Immunologisk Afdeling og Pædiatrisk Afdeling.

Ovenstående statusartikel bygger på en større litteraturgennemgang end litteraturlistens syv numre. Oplysninger om denne baggrundslitteratur kan fås fra forfatterne.