Nye sygdomsmarkører ved de kroniske myeloproliferative neoplasier

Essentiel trombocytose (ET) (Figur 1), polycytaemia vera (PV) og primær myelofibrose (PMF) (Figur 2) repræsenterer de klassiske myeloproliferative neoplasier (MPN). Det er hæmatologiske kræftsygdomme, som udgår fra knoglemarvens stamceller. Kendetegnet ved sygdommene er en autonomt hyperprolifererende knoglemarv, som resulterer i overproduktion af en eller flere af blodets modne celler. Klinisk ses en øget risiko for tromboemboli og/eller blødninger, samt varierende symptomer fra mikrocirkulationen, hypermetabole symptomer og hudkløe. PV og ET kan progrediere til post-PV- eller post-ET-myelofibrose, og alle tre typer MPN kan progrediere til akut myeloid leukæmi (AML) [1]. Allerede i 1951 introducerede Dameshek konceptet om et nært slægtskab mellem de tre sygdomme [2], hvilket molekylærbiologisk blev bekræftet i 2005 ved identifikationen af V617F-mutationen i JAK2 hos 98% af patienterne med PV og ca. 50% af patienterne med ET og PMF [3]. Mutationen medfører en ændring af valin til fenylalanin i kodon 617, hvorfor mutationen benævnes JAK2-V617F. JAK2 koder for Januskinase (JAK) 2, en proteinkinase, som aktiveres af bl.a. erytropoietinreceptoren og trombopoietinreceptoren (TPOR). JAK2-mutationen resulterer i en liganduafhængig aktivering af JAK2, der aktiverer nedstrømscellulære signalveje, bl.a. signal transducer and activator of transcription (STAT), der inducerer celleproliferation [1, 4]. Fundet af JAK2-mutationen har bidraget med ny viden om patofysiologien og patogenesen bag MPN samt forenklet diagnostikken, som tidligere beskrevet i Ugeskrift for Læger [5]. Diagnosticering af JAK2-negativ ET og PMF har pga. fraværet af klonale markører været en udfordring. Formålet med denne artikel er at beskrive de senere års nye molekylærbiologiske landvindinger inden for sygdomsgruppen, herunder bl.a. MPL-mutationen og det seneste molekylærbiologiske gennembrud – identifikationen af mutationer i calretikulin-genet (CALR).

MPL-MUTATION VED MYELOPROLIFERATIVE

NEOPLASIER

Allerede i 2006 identificeredes ved PMF en mutation i kodon 515 i MPL, der koder for TPOR. Mutationen indebærer en ændring af tryptofan til leucin og medfører en cytokinuafhængig vækst samt konstitutiv aktivering af JAK2 og de intracellulære proteiner STAT3 og STAT5 [6]. Mutationen er senere påvist hos patienter med ET, således at ca. 5% af alle JAK2-negative ET- og PMF-patienter har mutation i MPL [7, 8]. Mutationen påvirker TPOR’s juxtamembranøse cytoplasmatiske del, som forhindrer spontan aktivering af receptoren, hvilket stimulerer til celleproliferation. Siden er der beskrevet flere varianter af MPL-muta-

tionen, og der er identificeret patienter med samtidig MPL- og JAK2-mutation [7].

CALRETIKULINS BIOLOGI

På trods af fundet af MPL-mutationen manglede der indtil for nylig en markør for størstedelen af de JAK2-negative patienter med PMF eller ET. Gennembruddet kom i december 2013, da to uafhængige forskergrupper publicerede resultater, der påviste flere mutationstyper i CALR, som koder for proteinet calretikulin (CALR).

CALR er et protein på 46 kilodalton og er højt konserveret mellem arterne. CALR er 3,6 kilobasepar stort, sidder på kromosom 19 og består af 9 exoner og 8 introner [9]. Proteinet er opdelt i tre domæner: N-, P- og C-domænet, hvor N-domænet interagerer med chaperoner (proteiner, der faciliterer korrekt foldning af proteiner ved deres syntese), og P- samt C-domænet, der binder calcium. C-domænet er surt pga. mange negativt ladede aminosyrer og indeholder et retentionssignal, som varetager tilbageføring af CALR fra golgiapparatet til det endoplasmatiske retikulum (ER) [10].

Proteinet er lokaliseret til ER-lumen, cytosolen samt plasmamembranen, hvori øgede mængder udtrykkes ved brystcancer, hepatocellulært karcinom og prostatacancer [9, 11]. Proteinet er centralt for reguleringen af den intracellulære calciumkoncentration og indgår som chaperone i foldningen af major histocompatibility complex I-molekylet. CALR er desuden påvist at modulere aktiviteten i STAT3-systemet gennem chaperonen ERp57.

Strukturelle og funktionelle konsekvenser

af CALR-mutation

CALR-mutationerne ved MPN er alle somatiske mutationer, som er lokaliseret til exon 9 (Figur 3), der koder for den sure C-terminal. Mutationerne introducerer et skift i proteinets læseramme, hvilket medfører tab af ER-retentionssignalet og en ændring af C-terminalens surhedsgrad, så denne bliver mere basisk [11]. Indtil videre er der beskrevet 41 forskellige mutationer – de fleste insertioner eller deletioner og enkelte komplekse rearrangementer [12]. Størstedelen af mutationerne – 50-80% – udgøres af en 52-bp-deletion (type 1) eller en 5-bp-insertion (type 2). Type 1 medfører tab af alle negativt ladede aminosyrer i C-terminalen, og type 2 medfører tab af halvdelen [11].

Funktionelt har type 1-mutationen vist sig at inducere cytokinuafhængig vækst og øge sensitiviteten for interleukin 3 samt øge mængden af aktiveret STAT. Den cytokinuafhængige celleproliferation hæmmes af JAK-inhibitor, hvilket kan tolkes som, at celleproliferationen ved CALR-mutation er afhængig af JAK-STAT-systemet [13]. Dette fund understøttes af, at man vha. computerprogrammer har regnet sig frem til, at netop mutationer til første læseramme danner fosforyleringssites på CALR, som dermed kan aktivere nedstrømscellulære signalveje.

Mængden af CALR, der udtrykkes på plasmamembranens overflade, ændres ikke med mutation [14], og i longitudinelle retrospektive studier er det påvist, at CALR-mutationerne modsat JAK2-mutationen opstår tidligt i udviklingen af MPN [14].

CALR-mutationer forekommer i familier med ophobning af MPN og er alle somatiske, hvilket tyder på en ukendt arvelig genetisk læsion eller konstellation, der øger risikoen for udvikling af såvel JAK2-muteret som CALR-muteret MPN [12, 15].

Ved hjælp af immunhistokemisk undersøgelse med monoklonale antistoffer rettet mod muteret CALR er det klarlagt, at CALR – både muteret og vildtype – udtrykkes mest i megakaryocytter samt deres forstadier og i mindre grad i erytroide og granulocytære forstadier [16].

CALR-mutationerne er undersøgt ved såvel

myeloide som lymfoide neoplasier samt ved solide

tumorer og forekommer kun i førstnævnte [13]. CALR-mutation er påvist hos enkelte patienter med myelodysplastisk syndrom, atypisk kronisk myeloid leukæmi og kronisk myelomonocytær leukæmi [13]. Initialt blev CALR-mutation opfattet som en mutation, der aldrig forekom sammen med JAK2-muta-tion, men efterfølgende er der beskrevet enkelte patienter med samtidig CALR- og JAK2-mutationer [12]. Derudover foreligger der en enkelt kasuistik om to patienter med CALR-muteret og JAK2-umuteret PV.

CALR-mutationer ved MPN

CALR-mutationer ses hos 16-28% af alle ET-patienter og hos 49-70% af de JAK2- og MPL-negative [13, 17-20]. Ved PMF ses mutation hos 25-35% af alle patienter og hos 56-88% af de JAK2- og MPL-negative [13, 14, 21, 22]. Samtidig ses en signifikant øget forekomst af type 1-mutation i forhold til type 2-mutation ved PMF [13, 14].

CALR-muteret ET adskiller sig fra JAK2-muteret ET ved, at patienterne er yngre [17-19], flere er af mandligt køn [17, 18], har lavere hæmoglobinniveau og lavere leukocyttal [13, 17-19], højere trombocyttal [13, 14, 17-19], lavere S-erythropoietinniveau [18], lavere risiko for tromboemboliske episoder [13, 17-19] og færre mikrovaskulære symptomer [17]. Til gengæld ses der samme blødningsrisiko og risiko for progression til AML hos patienter med CALR-muteret ET som hos patienter med JAK2-muteret ET [17, 18]. I en enkelt kohorte fandt man øget risiko for post-ET-myelofibrose MF [14], hvilket dog ikke er påvist i et efterfølgende studie [18]. CALR-allelbyrden er større end den tilsvarende JAK2-allelbyrde hos de JAK2-muterede ET-patienter [18]. Type 2-mutation ved ET er ift. type 1-mutation associeret med signifikant højere trombocyttal og lavere alder [23].

I to studier har man fundet en øget overlevelse for personer med CALR-muteret ET end for personer med JAK2-muteret ET, men efter justering for alder var forskellen i et af de to studier ikke signifikant [13, 18]. I tre andre studier, hvoraf det ene var et langtidsstudie med en medianfollowupperiode på 12,7 år, blev der ikke påvist nogen forskel i overlevelse [17, 19, 20].

Sammenlignet med JAK2-muteret PMF har patienter med CALR-mutation lavere alder, færre er anæmiske og transfusionskrævende, og de har lavere leukocyttal, men højere trombocyttal. CALR-mutation giver væsentligt bedre overlevelse med en medianoverlevelse på 8,2 år sammenlignet med 4,3 år for JAK2-muteret PMF [21].

Som ved ET ses der forskel på klinikken mellem type 1- og type 2-CALR-muteret PMF, idet type 2-

mutation er associeret med leukocyttal > 10 × 10⁹, større mængde cirkulerende myeloblaster og en tendens i retning af dårligere overlevelse [22]. I samme studie fandt man en tendens til, at type 2-CALR-muteret PMF fænotypisk er mere lig JAK2-muteret PMF end type 1-CALR-muteret PMF. Grundlaget for denne konklusion er dog meget spinkelt, idet der i studiet kun indgik ti patienter med type 2-muteret PMF [22].

På baggrund af de nye mutationer, herunder bl.a. CALR-mutationen og mutationen i ASXL1, der koder for det histonregulerende protein additional sex combs like 1 (Drosophila), er der beskrevet nye prognosemodeller, hvor molekylærdiagnostikken indgår, som vigtige prognosemarkører til identifikation af patienter, som kan være kandidater til mere intensiv behandling i form af f.eks, allogen knoglemarvstransplantation [24].

TERAPEUTISKE IMPLIKATIONER OG PERSPEKTIVER

Behandling af CALR-muteret PMF med JAK-hæmmeren ruxolitinib reducerer miltstørrelsen og mængden af cirkulerende trombocytter, og senest er det påvist, at interferon (INF)-alpha2 kan reducere CALR-mutationsallelbyrden [25] – helt tilsvarende reduktionen i JAK2-allelbyrden under IFN-behandling [26]. I et retrospektivt studie med 133 patienter, som blev behandlet med allogen knoglemarvstransplantation var fireårsoverlevelsen ved CALR-muteret PMF 82% mod 56% ved CALR-umuteret PMF, p = 0,043 ved univariat analyse og p = 0,094 ved multivariat analyse [27].

CALR-mutationen kan måske få behandlingsmæssig betydning, idet muteret CALR muligvis er immunogent. CALR udtrykkes på celler i præapoptotisk fase, fungerer som et proapoptotisk signal og stimulerer dendritiske celler til fagocytose, hvilket igen stimulerer til et tumorspecifikt T-cellerespons [9, 11, 28]. Hermed er der skabt grundlag for immunologiske studier, der skal afdække helt nye terapimuligheder – vaccination og monoklonal antistofterapi. Med komplementære immuncellestudier før og under behandling med IFN vil man yderligere kunne belyse IFN’s effekt og virkningsmekanisme ved MPN-sygdommene. Vha. studierne vil man bl.a. kunne klarlægge, om CALR-muterede MPN-patienter har forandringer i cirkulerende immunceller identiske med dem, som er beskrevet hos JAK2-muterede patienter [29]. Signifikant flere CALR-muterede patienter, som har PMF og bliver behandlet med allogen knoglemarvstransplantation, får akut og kronisk graft versus host disease, hvilket tyder på, at muteret CALR har større immunstimulerende effekt end PMF [27], hvad der måske også vil få terapeutisk og prognostisk betydning.

Øget koncentration af anti-CALR-autoantistoffer er påvist hos bl.a. patienter med mave-tarm-cancer [30]. Tilsvarende studier af autoantistofdannelse over for CALR-mutationen hos MPN-patienter vil ved påvisning af autoantistoffer åbne op for prospektive studier, hvor man belyser den kliniske, terapeutiske og prognostiske betydning af forekomsten af autoantistoffer, herunder også om de kan anvendes som biomarkører for behandlingseffekt med bl.a. IFN.

KONKLUSION

CALR-mutation er en ny vigtig sygdomsmarkør for MPN, og i Danmark er den allerede implementeret rutinemæssigt som led i udredningen for MPN. CALR-mutationsstatus har for PMF vist sig at være af prognostisk værdi, især kombineret med mutationsstatus for ASXL1. CALR-muteret ET og PMF adskiller sig klinisk fra JAK2-muteret sygdom og kan overordnet karakteriseres som værende mere indolent. Muteret CALR som mål for immunterapi er en teoretisk mulighed, som potentielt åbner nye perspektiver i forhold til behandling af MPN.

Korrespondance: Hans Carl Hasselbalch, Hæmatologisk Afdeling, Roskilde

Sygehus, Køgevej 7-13, 4000 Roskilde. E-mail: hans.hasselbalch@dadlnet.dk

Antaget: 29. januar 2015

Publiceret på Ugeskriftet.dk: 4. maj 2015

Interessekonflikter: