Oxidativt stress og genetiske polymorfismer ved KOL

Kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) er en invaliderende tilstand med progredierende og irreversibel lungefunktionsnedsættelse. Kronisk obstruktiv lungesygdom kan initialt betragtes som organspecifik, men udvikles efterhånden til en systemsygdom, der overvejende er betinget af tobaksrygning. I de senere år har der været øget fokus på patofysiologiske årsagssammenhænge ved kronisk obstruktiv lungesygdom, og oxidativt stress er af flere forskergrupper foreslået som en af de grundlæggende mekanismer. Flere kliniske studier indikerer en kausal sammenhæng mellem tobaksrygning, oxidativt stress, øget inflammatorisk respons og destruktion af lungevæv. Artiklen gennemgår litteraturen vedrørende tobaksbetinget oxidativt stress som en præinflammatorisk tilstand, der fører til kronisk obstruktiv lungesygdom.

Kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) er årsag til betydelig morbiditet og mortalitet i Danmark og på verdensplan (1, 2). KOL opdeles traditionelt i kronisk bronchitis og emfysem, men blandingsformer ses ofte. Tobaksrygning er årsag til 90% af alle KOL-tilfælde, men kun 15-20% af alle rygere udvikler alvorlig KOL. Årsagerne til forskelle i følsomhed hos de enkelte rygere er ikke klarlagt. α -1-antitrypsin-mangel er foreløbig den eneste kendte disponerende genetiske faktor og har tjent som model for protease-antiprotease-teorien, hvor lungernes elasticitet og funktion påvirkes af nedbrydende enzymer (proteaser), der modreguleres af beskyttende enzymer (antiproteaser) (3, 4). Oxidativt stress er muligvis den udløsende molekylære begivenhed, der fører til ændring af protease-antiprotease-balancen og efterfølgende irreversibel skade på lungeparenkymet. Rygning kan inducere oxidativt stress, og flere studier viser stigning i biomarkører for oxidativt stress hos rygere og patienter med tobaksbetinget KOL (5-7).

Artiklen beskriver oxidativt stress og den foreliggende evidens for klinisk betydning af oxidativt stress i patofysiologien ved KOL. Emnet er omfangsrigt og præget af komplekse biomolekylære sammenhænge. Formålet er at give klinisk arbejdende læger en introduktion til den nyeste forskning inden for emnet. Ved behov for en mere detaljeret tilgang til emnet henvises til baggrundslitteraturen.

Oxidativt stress

Organismens cellulære aktiviteter kræver oxidation og reduktion af det kemiske miljø for at opnå optimal funktion. Dannelsen af frie radikaler (reactive oxygen species og reactive nitrogen species ) er en del af organismens normale oxidative metabolisme. I den normale organisme regulerer enzymatiske og non-enzymatiske systemer niveauet af frie radikaler. Selve begrebet oxidativt stress er uklart defineret, men kan forstås som en tilstand med vedvarende overvægt af oxidative produkter, primært pga. øget koncentration af frie radikaler (5, 7). Den primære endogene kilde til frie radikaler er mitokondriernes elektrontransportkæde. Fem procent af elektroner herfra reagerer med O2 og danner superoxidanion (O2- ), som er omdrejningspunktet i dannelsen af oxygenderiverede frie radikaler i lunger. En anden vigtig kilde til dannelse af superoxid er xanthinoxidase (XO), der katalyserer omdannelsen af purinnukleotider (5). Da superoxid er vævstoksisk, omdannes det af superoxiddismutase (SOD) til det intermediært reaktive stof hydrogenperoxid (H2 O2 ) (5, 6, 8, 9). H2 O2 omdannes herefter til H2 O af katalase og glutathionperoxidase. Glutathionperoxidase katalyserer endvidere oxidation af glutathion (GSH) til GSSG, som reduceres fortløbende i Krebs' cyklus til GSH af enzymet glutathionreduktase (GR) (5). Hvis ikke glutathionredoxsystemet i tilstrækkeligt omfang kan omdanne H2 O2 , kan neutrofil myeloperoxidase (MPO) fra neutrofile granulocytter omdanne H2 O2 til HOCl (hypochlorsyre), der er særdeles oxiderende og vævstoksisk (Boks 1 ).

Katalase og glutathion er således eksempler på antioxidanter (scavengers ). Såfremt superoxid ikke reduceres, dannes hydroxyanion (OH- ), der kan oxidere og derved skade DNA, RNA, proteiner og lipider. Netop oxidation af lipider kan monitoreres, eksempelvis ved niveauet af lipidperoxidase, P-lipidperoxid, ethan og pentan i udåndingsluft.

Andre kilder til frie radikaler er nitrogenoxid (NO), der ved reaktion med superoxid O2- danner det særdeles reaktive peroxynitrit (ONOO). Antioxidanten til begrænsning af denne reaktion er igen superoxiddismutase, og organismen har således for hvert potentielt skadeligt frit radikal en reguleringsmekanisme, der kan omdanne stoffet til mindre skadelige substanser (5, 8, 9). Sammenhængene er forenklet beskrevet og vises i Fig. 1A og Fig. 1B .

Oxidativt stress og tobaksrøg

Cigaretrøg er den vigtigste eksogene kilde til frie radikaler. Hvert sug af en cigaret indeholder op til 1017 oxidative radikaler, der fører en stor oxidativ byrde til lungeoverfladen. Tobaksrøg i luftvejene medfører øget epitelial permeabilitet og stimulerer makrofager og epiteliale celler til at frigive transkriptionsfaktor NF-κ B. Denne øger genekspression af inflammatoriske mediatorer, såsom interleukin-8, leukotrien B4 og TNF-α . Disse er neutrofile kemotaktiske faktorer, der på ny stimulerer neutrofile leukocytter, makrofager og CD8-cytotoksiske T-celler til at frigive talrige proteaser, eksempelvis neutrofil elastase, proteinase 3, cathepsiner og matrix-metalloproteinaser, der alle kan forårsage emfysem og mucushypersekretion (10). Rygning stimulerer migration af neutrofile granulocytter til lungekredsløbet. Disse frigiver enzymet MPO, hvilket ligeledes kan resultere i oxida tiv vævsskade (11).

Den humane organisme har normalt en stor antioxidativ kapacitet i blod og i væskefilmen, der beklæder bronkier, bronkioler og alveoler, ELF (epithelial lining fluid), eksempelvis antiproteaserne α -1-antitrypsin, secretory leukoprotease inhibitor (SLPI) og tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMP 1, 2 og 3), samt non-enzymatiske som glutathion. Sammenhængen er skitseret i Fig. 2.

Biomarkører for oxidativt stress, rygning og KOL

I det følgende omtales biomarkører for oxidativt stress ved KOL, skematisk beskrevet i Tabel 1 . Biomarkører er indirekte mål, da de direkte involverede biologiske substanser er flygtige og behæftet med måleusikkerhed. Det er muligt at måle biomarkører i udåndingsluft, sputum, væske fra bronkoalveolær lavage (BAL) og blod.

1. Biomarkører i udåndingsluft

I. Nitrogenoxid (NO). NO er et inflammationsprodukt og er fundet i forhøjet koncentration i eksspirationsluften (eNO) hos astmatikere. eNO korrelerer med mængden af eosinofile og neutrofile granulocytter i sputum hos patienter med KOL, og denne association indikerer en rolle i luftvejsinflammationen ved KOL (12-15). Betydningen af eNO ved stabil KOL er dog ikke afklaret (16, 17). Rutgers et al og Delen et al fandt ingen forskel i eNO mellem KOL-patienter og raske kontrolpersoner (18, 19), hvilket muligvis skyldes, at en beskeden stigning i eNO ved stabil KOL opvejes af, at rygning per se fører til lavere eNO (20). Således kan mangelfulde oplysninger om ryger/eksrygerstatus være en konfounder som vist af Robbins et al , der i et rygeafvænningsstudie fandt, at rygeophør i sig selv var associeret med en stigning i eNO (21).

II. Ethan og carbonmonoxid (CO). Ethan er et produkt af lipidperoxidation, der kan måles i udåndingsluft. Toogtyve patienter med KOL fik målt ethan i udåndingsluft og andre noninvasive markører af oxidativt stress og inflammation, herunder CO og NO. Sammenlignet med 14 raske kontrolpersoner havde KOL-patienter signifikant øget mængde ethan, CO og NO i udåndingsluften, og ethan var negativt korreleret med FEV1 . Patienter i behandling med glukokortikoid havde lavere niveau af ethan, hvorimod CO- og NO-mængden var ufølsom for steroid (22).

III. Hydrogenperoxid (H2O2) . En øget mængde hydrogenperoxid i udåndingsluft (eH2 O2 ) er beskrevet ved flere akutte lungesygdomme, og eH2 O2 -måling anses for at være en simpel måde til påvisning af luftvejsinflammation. Guatura et al målte eH2 O2 før og efter inhalation af en cigaret hos 12 raske cigaretrygere sammenlignet med eH2 O2 hos ti ikkerygere. Rygere fik en signifikant stigning en halv time efter en cigaret (23). Dekhuijzen et al fandt signifikant højere værdier af eH2 O2 hos personer med KOL end hos en rask kontrolgruppe og signifikant højere værdier ved akut eksacerbation end ved stabil KOL (24). Disse fund støttes af andre undersøgelser, hvor man har fundet en signifikant stigning i eH2 O2 hos patienter med bronkiektasier, der ikke sjældent ses ved KOL (25).

IV. Isoprostaner . Prostaglandinisomerer (F2- og 8-isoprostan) produceres in vivo ved frie radikalers peroxidation af arachidonsyre (26). Montuschi et al målte 8-isoprostan-koncentration i udåndingskondensat hos ti raske ikkerygere og 12 raske rygere samt 40 patienter med KOL, 15 rygere og 25 eksrygere. 8-isoprostan-koncentrationen var sammenlignelig i hele KOL-gruppen og signifikant forhøjet i forhold til raske rygere, der igen havde signifikant forhøjede værdier i forhold til raske ikkerygere (27).

2. BAL-væske, induceret sputum og blod

NO og MPO kan måles i induceret sputum, men der er kun få og inkonsistente resultater (28). For BAL-væske og blod foreligger flere studier.

I. Neutrofil myeloperoxidase (MPO). Hill et al fandt MPO, IL-8, leukotrien B4 og neutrofil elastase signifikant forhøjet i induceret sputum hos patienter med kronisk bronchitis (29). I et studie med bronkoskopi med BAL af patienter med kronisk bronchitis fandt Riise et al signifikant stigning af MPO og IL-8 i BAL-væsken i forhold til raske kontrolpersoner, med korrelation til bakteriel infektion (30).

II. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) . De akutte og kroniske virkninger af tobaksrygning på oxidativt stress og inflammation kan vurderes ved måling af TEAC, som er et udtryk for den totale antioxidative kapacitet (bedømt ved bl.a. antioxidanterne albumin, urat, ascorbat, α -tocopherol og bilirubin). Fjorten cigaretrygere blev bronkoskoperet med BAL efter 12 timers tobaksabstinens (kronisk rygning) og en time efter to cigaretter (akut rygning). Syv ikkerygere blev ligeledes bronkoskoperet med BAL. Neutrofile granulocytter i BAL-væsken var signifikant øget i gruppen af akutte rygere sammenlignet med ikkerygere. Superoxidanion i plasma var signifikant øget både efter akut og kronisk rygning tydende på lipidperoxidation. TEAC var signifikant reduceret i plasma og øget i BAL-væske i begge rygergrupper (31). Dette understøttes af et studie, hvor TEAC i plasma fandtes signifikant reduceret med øget grad af lipidperoxidationsprodukter hos raske kroniske rygere sammenlignet med raske ikkerygere. Plasma-TEAC er nedsat hos patienter med akut eksacerbation i KOL med stigning i plasma-lipidperoxidationsprodukter, ligesom der er en negativ korrelation mellem superoxidanion og plasma-antioxidativ kapacitet (32).

III. Xanthinoxidase (XO). Heunks et al fandt signifikant stigning af XO og oxideret glutathion i arterielt blod som udtryk for oxidativt stress og lipidperoxidation ved hård fysisk træning med øget respirationsarbejde hos KOL-patienter (33). Dette støttes af Pinamonti et al's studie med BAL-undersøgelser af patienter med KOL, hvor man fandt, at XO var signifikant forhøjet og associeret med dannelsen af superoxid og derved udtryk for stigende oxidativt stress (34).

Oxidativt stress og genetiske polymorfismer ved KOL

Følsomhed for tobaksrøg varierer blandt rygere. Genetisk betinget susceptibilitet for tobaksrøgens skadelige virkninger grundet ændret enzymatisk antioxidativ kapacitet kan forklare udvikling af KOL hos en femtedel af tobaksrygere (Boks 2 ).

Smith et al undersøgte, om polymorfismer ved genet for mikrosomal epoxidhydrolase (mEPHX), et enzym involveret i lungernes antioxidative respons, er associeret med KOL. I alt 203 bloddonorer fungerede som kontrolgruppe i en undersøgelse af 57 patienter med asthma, 50 p atienter med lungekræft, 68 med kronisk bronchitis og 94 med emfysem. Homozygote med nedsat mEPHX-aktivitet var signifikant overrepræsenteret i kronisk bronchitis- og emfysemgrupperne i forhold til kontrolgruppen. Odds ratio for homozygot nedsat aktivitet af mEPHX over for alle fænotyper var 4,1 for kronisk bronchitis og 5,0 for emfysem (35). Tilsvarende forhold er fundet af Yohikawa et al (36), men modsiges i studier med koreanske og japanske KOL-patienter (37, 38). Ishii et al undersøgte for polymorfismer ved glutathion S-transferase P1 locus (GSTP1) hos 53 patienter med KOL og 50 raske kontrolpersoner. Antallet af GSTP1-homozygote var signifikant højere hos KOL-patienter (79%) end raske (52%). Odds ratio for GSTP1 for at have KOL blandt homozygote over for alle andre genotyper var 3,5 (39). Genetisk variation af glutathion S-transferase M1 locus (GSTM1) er undersøgt ved lungekræft. Emfysem og lungekræft kan være forårsaget af lignende kemisk og oxidativ skade grundet frie radikaler i cigaretrøg. GSTM1 menes at beskytte imod sådanne skader ved afgiftning af cigaretrøgens komponenter, og polymorfismer i dette gen tænkes at kunne påvirke følsomheden ikke kun for lungekræft men også for andre former for lungesygdomme. Resektionsvæv fra 168 lungekræftpatienter blev vurderet med henblik på grad af emfysem. DNA blev ekstraheret og genotypeanalyseret for GSTM1-polymorfismer. En kontrolgruppe med 384 bloddonorer blev brugt til at bestemme frekvensen af GSTM1-gendeletion i en tilfældig population. I 57 tilfælde af lungekræft uden koeksisterende emfysem fandtes ingen association med GSTM1-genet. Hos 111 patienter med emfysem og lungekræft fandtes en signifikant stigning i frekvensen af deletion med odds ratio på 1,4. I 43 tilfælde med centriacinært emfysem steg frekvensen af GSTM1-deletion yderligere til 70%, odds ratio 2,1. GSTM1 kan således have en lille beskyttende effekt imod toksikologisk lungeskade, som ikke er specifik for kræft (12). I et fransk materiale af KOL-patienter og lungeraske storrygere fandtes en lignende association (40). Polymorfismer ved generne for cytochrom p4501A1 (CYP1A1), TNF-α -aktivitet og α -1-chymotrypsin er sparsomt belyst og for øjeblikket uden sikker sammenhæng med KOL.

Kommentar

At den enkelte rygers genetisk betingede evne til at modstå tobaksbetinget oxidativt stress er medvirkende til at fastlægge følsomheden for tobaksrøg, er en interessant og plausibel hypotese. En del humane studier giver grundlag for at arbejde videre med denne teori. Endnu foreligger dog ikke studier, der overbevisende kan demonstrere, at oxidativt stress er den faktor, som formidler den tobaksinducerede vævsskade. Det er således muligt, at biomarkører for oxidativt stress blot optræder som epifænomener ved udvikling af KOL. Interventionsstudier vedrørende oxidativt stress og KOL er få og små, og i de undersøgte grupper er der ofte ikke skelnet mellem kronisk bronchitis og emfysem. Værdien af disse studier er beskeden.

Flere eksperimentelle studier har imidlertid vist, at tobaksrøg indeholder adskillige oxygen- og nitrogenderiverede frie radikaler. Rygere og KOL-patienter udskiller en øget mængde oxidationsprodukter, og niveauet stiger yderligere ved eksacerbation af KOL. Cellulære og enzymatiske antioxidantsystemer hos rygere og KOL-patienter er påvirket i negativ retning, og der er vist en sammenhæng mellem frie radikaler, oxidativt stress og øget inflammationstilstand målt ved CRP, TNF-α o.l. De omtalte metoder bruges primært i videnskabelig sammenhæng, dog er NO og H2 O2 i udåndingskondensat i klinisk brug som markør for luftvejsinflammation i engelsktalende lande. Inflammation er et kritisk punkt i patofysiologien ved KOL, og oxidativt stress synes ved gennemgang af den foreliggende litteratur at være en væsentlig præinflammatorisk komponent. Det er kendt, at α -1-antitrypsin-mangel kombineret med rygning fører til udvikling af pulmonalt emfysem (4). En lignende genetisk betinget mekanisme med nedsat eller manglende funktion af antioxidative forsvarssystemer kan svække den totale antioxidative kapacitet med risiko for vævsskade og herunder udvikling af emfysem. Ved udsættelse for tobaksrøg synes der at være en øget risiko for udvikling af KOL ved genetisk polymorfi af regioner, der koder for antioxidativ funktion. Det er således nærliggende at forestille sig, at varierende funktion af de antioxidative systemer kunne medvirke til at forklare forskelle i følsomhed for tobak ved udvikling af KOL.

Óli Jacob Dalsgar , lungemedicinsk klinik 223/klinisk forskningsenhed 136, H:S Hvidovre Hospital, DK-2650 Hvidovre.

E-mail: oliboli@dadlnet.dk eller oli.dalsgard@hh.hosp.dk

Antaget den 25. februar 2002.

H:S Hvidovre Hospital, lungemedicinsk klinik og klinisk forskningsenhed.

Ovenstående artikel hviler på en større litteraturgennemgang end litteraturlistens 40 numre. Oplysninger om baggrundslitteraturen kan fås fra forfatterne.

1. Barnes PJ. Chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med 2000; 343: 269-80.
2. Lange P, Hansen JG, Iversen M, Madsen F, Munch E, Rasmussen FV et al. Diagnostik og behandling af kronisk obstruktiv lungesygdom. Oversigt og vejledende retningslinjer. Ugeskr Læger 1998; 160 (suppl 1).
3. Koyama H, Geddes DM. Genes, oxidative stress, and the risk of chronic obstructive pulmonary disease. Thorax 1998; 53 (suppl 2): S10-4.
4. Silverman EK, Chapman HA, Drazen JM, Weiss ST, Rosner B, Campbell EJ et al. Genetic epidemiology of severe, early-onset chronic obstructive pulmonary disease. Risk to relatives for airflow obstruction and chronic bronchitis. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157: 1770-8.
5. Heunks LM, Dekhuijzen PN. Respiratory muscle function and free radicals: from cell to COPD. Thorax 2000; 55: 704-16.
6. Repine JE, Bast A, Lankhorst I. Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease. Oxidative Stress Study Group. Am J Respir Crit Care Med 1997; 156: 341-57.
7. MacNee W, Rahman I. Oxidants and antioxidants as therapeutic targets in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160: S58-S65.
8. Jensen SA, Jensen BR, Weiman A, Li L, Poulsen HE. Oxidativ stress og aldring. Ugeskr Læger 2000; 162: 2431-5.
9. Rahman I, MacNee W. Role of oxidants/antioxidants in smoking-induced lung diseases. F