Akademisk afhandling
Production and high-throughput analysis of MHC and MHC-like molecules
7. nov. 2008
2 min.
Ph.d.-afhandlingen udgår fra Institut for International Sundhed, Immunologi og Mikrobiologi, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet.
Major histocompability complex klasse II (MHC II)-molekyler er polymorfe overflademolekyler, som intracellulært binder peptidfragmenter af ekstracellulært oprindelse. MHC II-molekylet er heterodimert og består af membranankrede a- og b-kæder, som tilsammen danner en kløft, hvori peptidfragmenter kan binde.
I første del af denne ph.d.-afhandling beskrives udviklingen af et MHC II-peptidbindings-assay baseret på α - og β -kæder udtrykt individuelt i Escherichia Coli. Peptidbindings-assayet udføres ved at fortynde de to kæder ud i en titreringsrække af peptid og efterfølgende måle mængden af dannet kompleks. Fra dosis-respons-kurven udregnes efterfølgende ligevægtsdissociationskonstanten (KD ). For nogle MHC II-alleler blev der udviklet et inhiberings-assay, dette inkluderer en meget lav koncentration af et biotinmærket peptid i titreringsrækken. Ud fra inhiberingskurven kan en indhiberingskonstant (IC50 ) udregnes, inhiberingskonstanten defineres som den koncentration af umærket peptid, der kræves for at inhibere indbindingen af mærket peptid med 50%. Begge assays blev udviklet på basis af det homogene luminescensoxygenkanaliserings (LOCI)-assay.
De udviklede assays muliggør bestemmelsen af affiniteter mellem peptider og de følgende MHC II-alleler: I-Ed (murine) og HLA-DR1, -DR2a, -DR3, -DR4, -DR8 og -DP401.
Den neonatale Fc-receptor er strukturelt tæt relateret til MHC I. Den associerer også med den lette kæde fra MHC I-komplekset (beta 2-mikroglobulin, β2 m), men binder ikke peptid. I stedet binder den immunglobulin (IgG) og albumin på en pH-afhængig facon, således at IgG bindes med høj affinitet ved pH 6, mens albumin bindes med en lavere affinitet. FcRn menes at redde IgG og albumin fra lysosomal nedbrydning ved at binde til disse i sure endosomer og efterfølgende recirkulere dem tilbage til celleoverfladen. Mekanismen kan forklare den usædvanligt lange halveringstid i blodet, som kendetegner disse to molekyler i forhold til andre plasmaproteiner.
Ved manipulering med FcRn-interaktionen kan man frembringe antistoffer, albuminer eller andre molekyler med ændrede farmakokinetiske egenskaber. Der er derfor en stor interesse i at studere FcRn-interaktionen og de bagvedliggende mekanismer. Til dette formål er der behov for store mængder af funktionelt FcRn. I dette arbejde vil vi beskrive den bakterielle ekspression og efterfølgende refoldning af funktionelt FcRn.
Ydermere vil vi komme med eksempler på, hvorledes de fremstillede receptorer kan udnyttes, f.eks. ved etablering af et assay til at screene interaktioner mellem FcRn og andre molekyler med.