RNA-interferens - vejen til individualiseret genetisk medicin

Når Nobelprisen i medicin/fysiologi 2006 i denne uge tildeles Andrew Fire & Craig Mello, sker det på baggrund af deres epokegørende studier af geners regulering i rundormen Caenorhabditis elegans (C. elegans) [1]. Der kan synes langt fra rundorme og bonede gulve i Stockholm til medicinsk gennemslagskraft og relevans, men Fire & Mellos opdagelser har intet mindre end revolutioneret molekylærgenetisk forskning og har for længst tiltrukket klinikeres opmærksomhed verden over. At prisen gives nu - kun otte år efter publiceringen af det oprindelige studium - er ganske usædvanligt og viser med al tydelighed vigtigheden af rundormens afslørede hemmeligheder.

Med C. elegans som eksperimentielt modelsystem søgte Fire & Mello at belyse de mekanismer, der regulerer strømmen af genetisk information i celler. De var specielt optaget af, at udtrykket af gener i rundormens celler tilsyneladende kunne nedreguleres af kunstigt tilførte RNA-molekyler. Ifølge molekylærbiologiens centrale dogme afkodes cellens genetiske information i form af dobbeltstrenget DNA til enkeltstrenget messenger-RNA (mRNA) - cellens budbringer af genetisk information - der processeres og transportes ud af cellekernen og translateres til protein i cellens cytoplasma.

Fire & Mello fandt til deres store overraskelse, at geners udtryk i C. elegans meget effektivt kunne nedreguleres eller helt slukkes ved at indføre dobbeltstrenget RNA i rundormens celler [1]. Dette var ikke en opdagelse blot for de specielt indviede i C. elegans -biologien, men også den første iagttagelse hos dyr af RNA-interferens (eller RNAi), en evolutionært konserveret og sekvensspecifik mekanisme for posttranskriptionel regulering af geners aktivitet. Planteforskere havde tidligere identificeret en lignende mekanisme i planter [2], og man har i nyere studier påvist, at RNAi har betydning for geners regulering i mange, hvis ikke alle, eukaryote organismer [3].

Hvorfor nu al den opmærksomhed? Svaret er todelt: 1) Opdagelsen af RNAi kaster helt nyt lys på vores genom og udvikling af genetiske sygdomme. Rækken af genetiske sygdomme, der skyldes fejl i proteinkodende gener, er som bekendt meget lang, og for mange sygdomme er de molekylærgenetiske årsager nøje beskrevet. Er det muligt, at genetiske sygdomme kan skyldes geners fejlregulering som følge af fejl i RNAi-maskineriet, eller at RNAi-processer kan have en supplerende rolle i sygdomsudvikling? Vi kender stadig ikke det præcise svar, men ved i dag, at nedsatte niveauer af visse dobbeltstrengede RNA-molekyler (såkaldt miRNA), der afkodes fra distinkte loci i vores genom, synes at korrelere med udvikling af adenokarcinomer (f.eks. kolorektal adenokarcinom) og kronisk lymfatisk leukæmi. Det foreløbige estimat forudsiger, at ca. 30% af vores gener reguleres af miRNA-molekyler via cellens RNAi-apparat. 2) De åbenlyse terapeutiske muligheder i RNAi er måske den væsentligste årsag til den store interesse ikke mindst fra den molekylærmedicinske verden og lægemiddelindustrien. I et utal af in vitro- og in vivo-studier har man allerede påvist, at dobbeltstrenget RNA-sekvens specifikt kan slukke for gener og dermed forhindre produktion af sygdomsfremkaldende proteiner, der ikke er mulige målmolekyler i konventionelle behandlingsstrategier. En række lovende prækliniske undersøgelser med forsøgsdyr synes at kunne bane vejen for anvendelse af RNA-baserede præparater hos patienter. Således er kliniske testforsøg igangsat i USA. Vi beskriver her den molekylære baggrund for RNA-interferens og giver eksempler på terapeutisk anvendelse af RNAi på vej mod udvikling af individualiseret genetisk medicin.

Fra cellulær forsvarsmekanisme til instrument i individualiseret genetisk behandling

RNAi aktiveres ved tilstedeværelse af dobbeltstrenget RNA, der f.eks. introduceres i celler i forbindelse med virusinfektion (Figur 1, venstre panel). Dobbeltstrenget RNA kløves i mindre stykker a 21-23 basepar, kaldet siRNA (for small interfering RNA) af proteinkomplekset Dicer. Efterfølgende genkendes siRNA af proteinkomplekset RISC, der ud fra termodynamiske parametre udvælger en af de to siRNA-strenge. Herefter søger RISC i kompleks med siRNA (nu enkeltstrenget) efter en mRNA-streng med komplementær sekvens, og efter dannelse af komplementær baseparring mellem siRNA og mRNA kløves og nedbrydes mRNA-strengen med nedsat produktion af f.eks. viralt protein til følge. Det er altså mRNA og ikke genet i sig selv, der er målet for genregulering via RNAi. Der er ikke fundet endogent udtrykt siRNA hos mennesker. Derimod producerer menneskers celler miRNA, der forlader kernen som et hårnåleformet præ-miRNA (Figur 1, højre panel). I cytoplasmaet kløves præ-miRNA af Dicer til miRNA, der binder til RISC og mRNA i nævnte rækkefølge. I modsætning til siRNA er baseparringen mellem miRNA og mRNA ikke fuldstændig, og miRNA/mRNA-komplekset inducerer ikke kløvning af mRNA-strengen, men hæmmer i stedet translation af protein.

Hvordan kan vi udnytte den cellulære RNAi-mekanisme til terapeutisk regulering af gener? siRNA kan tilføres direkte i form af 1) syntetisk siRNA bestående af to korte RNA-strenge eller 2) som kort hårnåleformet RNA (shRNA), der afkodes fra et DNA-molekyle, f.eks plasmid DNA (Figur 1). I eukaryote celler processeres syntetisk siRNA og shRNA i RNAi-maskineriet og resulterer i allelspecifik nedregulering af cellulære gener. Terapeutisk effekt af siRNA-medieret nedregulering af gener afhænger bl.a. af holdbarheden af siRNA i serum. Da umodificeret siRNA har en kort halveringstid (omkring en time), der primært skyldes tilstedeværelse af endonukleaser i serum og renal/hepatisk clearance, er stabiliteten via kemiske modifikationer blevet forbedret markant. Desuden har man udviklet flere strategier for effektiv overførsel baseret på indkapsling af siRNA. I de mest lovende forsøg forbedres overførslen signifikant ved at pakke siRNA i nanopartikler bestående af f.eks. lipid, polyetylenimin eller kitosan.

shRNA kodes fra en kilde af DNA (f.eks. plasmid), der forinden er overført til målorganet ved hjælp af virale eller ikkevirale overførselsstrategier. En vigtig forskel mellem syntetisk og DNA-kodet siRNA er, at sidstnævnte typisk har persistent effekt. Da virale strategier baseret på vektorer afledt fra adenovirus, lentivirus og adenoassocieret virus tillige har høj overførselseffektivitet, synes disse i flere sammenhæ nge at være velegnede i sammenligning med ektopisk administreret RNA eller siRNA. Det kan dog være problematisk, at virale vektorer potentielt fremprovokerer immunologiske reaktioner, og for flere virale strategier vil fremmed DNA integreres i arvemassen med risiko for at ramme essentielle gener. Meget forskning sigter dog på integration af shRNA-kodende DNA i kromosomalt DNA for derved at opnå stabil ekspression af shRNA og persistent RNAi-effekt og således undgå hyppige behandlingsgentagelser.

Uanset hvordan en klinisk effekt af RNAi søges opnået, er målet det samme: sekvensspecifik nedregulering af et på forhånd udvalgt gen. Med vores nuværende kendskab til menneskets arvemasse og den nære fremtids muligheder for high throughput-sekventering af større eller mindre bidder af den enkelte patients arvemasse åbner RNAi døren for effektiv individualiseret behandling. Specificiteten af siRNA betyder, at der kan skelnes mellem raske og syge alleller, der afviger på kun en enkelt nukleotidposition. RNAi er den molekylære afbryderknap, der kan slukke cancergener, dominant negative mutationsalleller eller virale gener, der er aktive i forbindelse med f.eks. hiv-infektion.

Terapeutisk anvendelse af RNAi

I betragtning af RNAi-metodens relativt unge alder er der allerede publiceret et stort antal in vivo-studier relateret til præklinisk udvikling af siRNA-lægemidler. Resultaterne fra disse studier har internationalt ansporet mere end 30 farmaceutiske og bioteknologiske firmaer til at påbegynde udvikling af terapeutiske præparater baseret på RNAi-teknologien. Som det fremgår af Tabel 1 anvendes RNAi allerede i en lang række prækliniske og kliniske forsøg til behandling af bl.a. infektionssygdomme, cancer, neurodegenerative sygdomme, okulære lidelser og allergi.

Til behandling af aldersrelateret maculadegeneration (AMD), der er den dominerende årsag til svært irreversibelt synstab hos ældre i den vestlige verden, er RNAi blevet anvendt som terapeutisk middel i kliniske fase II-forsøg. Der er kumulativ evidens for, at vaskulær endotelial vækstfaktor (VEGF) spiller en kausal rolle i udviklingen af AMD. Behandlingsregimener baseret på RNAi til modulering af effekten af VEGF er derfor under udvikling. Nedregulering af VEGF receptor 1 ved gentagne periokulære eller intravitreale injektioner af syntetisk siRNA resulterede i signifikant reduktion i koroidal neovaskularisering [4]. I mus kunne en enkelt subretinal injektion af en adenovirusbaseret vektor, der udtrykker shRNA rettet mod VEGF, hæmme udviklingen af koroidal neovaskularisering [5]. Der er derfor god grund til at antage, at shRNA-medieret nedregulering af VEGF alternativt i kombination med shRNA rettet mod andre gener, såsom VEGF receptor 1, kan vise sig at være en potent strategi til behandling af AMD.

Inhibition af respiratorisk syncytialvirus (RSV), der er en kausal komponent i udvikling af alvorlig respiratorisk sygdom, ofte med høj mortalitet, er et andet lovende forsøg på terapeutisk anvendelse af RNAi. I en in vivo-model for RSV-infektion resulterede nasal overførsel af siRNA til lungevævet i signifikant reduktion af pulmonal viral titer [6]. Bemærkelsesværdigt viste analyser af respirationsfrekvens, pulmonal inflammation og leukotrieninduktion, at siRNA-behandling hæmmede patogenesen med såvel præventiv som kurativ effekt til følge. Senest er potentialet af siRNA-overførsel til pulmonale epitelceller blevet fremhævet i danske studier ved kombineret anvendelse af kitosanindkapslede nanopartikler og nasal administration [7].

I forsøg på at nærme sig en strategi, der er klinisk anvendelig, udførte Zimmermann et al en række forsøg med aber med det mål at nedregulere apolipoprotein B (ApoB) ved systemisk overførsel af siRNA [8]. ApoB er et essentielt protein, der indgår i transport og metabolisme af kolesterol. Et forhøjet niveau af ApoB korrelerer med en forhøjet risiko for koronar sygdom, men som et stort lipidassocieret protein er ApoB ikke et tilgængeligt mål ved brug af konventionel terapi. Intravenøs injektion af syntetisk siRNA indkapslet i lipidpartikler resulterede i specifik nedregulering af ApoB med maksimal effekt efter 48 timers behandling. Som konsekvens heraf faldt niveauet af såvel ApoB-protein, serumkolesterol og lavdensitetslipoprotein (LDL) signifikant allerede efter 24 timer og forblev lavt i op til 11 dage. Zimmermann et al konkluderede derfor, at siRNA er en hurtig, potent og langtidsholdbar strategi til klinisk relevant reduktion af LDL-kolesterol, og at en enkelt injektion af syntetisk siRNA resulterer i betydelige fænotypiske ændringer.

shRNA-medieret RNAi er på elegant vis blevet anvendt til behandling af hepatitis B-virus (HBV) [9]. I en in vivo-model for HBV resulterede injektion af en vektor baseret på adeno-associeret virus (AAV) i effektiv og vedvarende ekspression af shRNA rettet imod HBV. Inden for de første to uger faldt mængden af hepatitis B-antigen (HBsAg) hurtigt til under 10% af det niveau, der blev observeret ved behandlingsstart. Mere interessant stabiliseredes mængden af HBsAg efter seks uger og frem til forsøgets afslutning mere end fem måneder senere på et lavt terapeutisk niveau. I lighed hermed observeredes der en kraftig reduktion af virus-DNA i serum. Set i lyset af disse resultater og af at AAV-medieret genoverførsel tilsyneladende er uden bivirkninger, kan terapeutisk anvendelse af RNAi snart vise sig at blive en realitet.

Perspektiver

Fire & Mello antydede i deres banebrydende artikel, at »RNA-interferens må være der for at tjene et biologisk formål«. Meget tyder på, at vi indtil nu kun har skrabet i overfladen, og at RNAi ikke bare tjener et formål, men repræsenterer et helt nyt og selvstændigt niveau for regulering af vore geners aktivitet med betydning for genetisk sygdom og diagnostik.

Når vi gør status over RNAi-teknologiens terapeutiske potentiale er det, teknikkens unge alder taget i betragtning, med videnskabelig begrundet optimisme. I laboratorier verden over anvendes RNAi allerede i dag som en standardmetode til studier af geners funktion. Hertil kommer nye tiltag, der viser udviklingen af levedygtige transgene husdyr med produktion af siRNA rettet mod f.eks. RNA, der koder for bovine prioner [10]. På baggrund af forsøg med celler og dyr tilpasses regelsættet løbende for optimalt genetisk design af syntetisk og DNA-kodet siRNA. Det er dog vigtigt at pointere, at ikke alle korrekt konstruerede siRNA-molekyler vil have den ønskede genregulerende effekt, da strukturelle egenskaber af mRNA transkriberet fra gener kan betyde, at der ikke er direkte adgang til siRNA-molekylets målsekvens. Det kan derfor være nødvendigt at teste en række forskellige siRNA, typisk i størrelsesordenen 4-6 for at finde den mest effektive variant.

Anvendelsen af dobbeltstrenget RNA som lægemiddel tiltrækker lige nu massiv interesse. De første kliniske forsøg er igangsat, og mange flere vil komme til i forbindelse med en lang række forskellige sygdomme. RNAi-teknologiens største fortrin er, at ethvert gen i princippet kan rammes på det posttranskriptionelle niveau uden detaljeret kendskab til f.eks. strukturen af det protein, som genet koder for. Derfor er teknikken universel og kan tilpasses helt specifikt til den enkelte patient på baggrund af sekvensvariationer i et sygdomsgen. Hertil kommer teknologiske fremskridt for in vivo-administrering af siRNA som følge af de enorme resurser, der i øjeblikket anvendes på nanoteknologiske og virale overførselsmetoder. Som med andre nye behandlingsstrategier er der udfordringer, der skal tackles. Det vil således være nødvendigt at teste, hvorvidt et lovende siRNA-præparat har præference kun for det på forhånd ønskede gen. I helt nye studier har man påvist en anden potentiel faldgrube; store mængder DNA-kodet siRNA kan nemlig mætte celletransportveje, der har betydning for endogene miRNA-molekylers funktion [9]. Det er derfor vigtigt nøje at tilpasse mængden af effektormolekyler, der produceres fra f.eks. virale vektorer.

Med C. elegans som springbræt synes RNA-interferens at bane vejen for medicin, der kan skræddersyes til det enkelte sygdomsgen og det enkelte individ. I eget regi fortsætter anvendelsen af RNAi til udredning af den cellulære patogenese i mitokondriel dysfunktion og neurodegenerative sygdomme samt med fokus på genetisk nedregulering af proinflammatorisk cytokinproduktion i inflammatoriske lidelser med henblik på fremtidige behandlingsforsøg.

Jacob Giehm Mikkelsen, Institut for Human Genetik, Aarhus Universitet, DK-8000 Århus C. Email: giehm@humgen.au.dk

Antaget: 15. november 2006

Interessekonflikter: Ingen angivet

Artiklen bygger på en større litteraturgennemgang. En fuldstændig litteraturliste kan fås ved henvendelse til forfatterne.