Screening for fragilt X-syndrom

###vp48608-1###

Fragilt X-syndrom (FXS) er den hyppigste årsag til familiær mental retardering, og efter vore beregninger er der ca. 700 ikkediagnosticerede tilfælde i Danmark. Da sygdommen er alvorlig, og molekylærdiagnostik er mulig, må screening for FXS overvejes for herved at forbedre den genetiske rådgivning. Ifølge internationale erfaringer bør der satses på forbedret opsporing af FXS hos personer med generel udviklingsforsinkelse og på kaskadescreening med henblik på anlægsbærerdiagnostik. Screening af gravide kan komme på tale, når forbedrede diagnostiske metoder muliggør det.

Fragilt X-syndrom (FXS) er en arvelig sygdom, som medfører udviklingshæmning og indlæringsvanskeligheder. Andre symptomer forekommer også, f.eks. adfærdsmæssige symptomer i form af hyperaktivitet og autistiske symptomer. FXS rammer ca. 1 ud af 4.000 drenge og ca. 1 ud af 8.000 piger. Det er dermed den hyppigste årsag til hereditær mental retardering. Drenge/mænd med FXS er som hovedregel så svært handicappede, at de har brug for omfattende livslang social støtte, mens piger/kvinder oftere kan klare en selvstændig tilværelse.

Der er for øjeblikket ingen kurativ behandling, men specialpædagogik og psykosocial intervention kan forbedre livskvaliteten, og medicinsk behandling kan komme på tale, f.eks. for hyperaktivitet [1-3].

Sygdommens alvor, relative hyppighed og de diagnostiske muligheder gør, at screening for sygdommen overvejes. Efter en kort indledning om sygdommens genetik, gives der en oversigt over internationale erfaringer med FXS-anlægsbærerscreening.

Materiale og metoder

Der foreligger tre health technology assessments (HTA) [1-3], svarende til dansk medicinsk teknologivurdering (MTV), vedrørende screening for FXS. I disse tre HTA har man bl.a. beskæftiget sig med effektiviteten, teknologien og omkostninger af forskellige screeningsstrategier og med evidens for grad af accept og gennemførlighed. I det følgende tages der afsæt i disse HTA-undersøgelser og supplerende litteratur, idet litteratursøgning er foretaget indtil sommeren 2005 ved søgning online på PubMed med søgeordene fragile X syndrome screening.

Genetik

FXS forårsages af en mutation i genet (fragile X mental retardation gene 1,FMR1 ), som er lokaliseret i Xq27.3-regionen på den lange arm af X-kromosomet [4]. Genet koder for et protein, FMRP, som findes i de fleste væv, men specielt i hjerne- og nervevæv, hvor det synes at spille en vigtig rolle for transport af specifikke mRNA fra cellekerne til cytoplasma og for regulering af proteinsyntesen.

FMR1- genet indeholder en repeteret sekvens af variabel længde, i hvilken trinukleotidrækkefølgen med baserne cytosin-guanin-guanin (CGG) er gentaget. Et normalt FMR1- gen indeholder fra fem til færre end 55 CGG-repeats, idet de fleste indeholder 28-30 CGG-repeats. Mutationen, der forårsager FXS, består i en ekspansion af den repeterede sekvens, således at en allel, der indeholder 55-200 repeats, har en præmutation (PM), og en allel med > 200 repeats har en fuld mutation (FM) [5]. Den fulde mutation bevirker, at FMR1- genets promotor metyleres, hvorved transkription af genet og dermed syntesen af FMRP blokeres. Sygdommen FXS skyldes således fraværet af dette vigtige protein (Figur 1 ).

Hos alle drenge og ca. halvdelen af pigerne med FM udvikles der FXS, idet symptomerne hos pigerne dog ofte er mildere. Halvdelen af pigerne med FM udvikler sig normalt og er anlægsbærere. X- kromosomets inaktiveringsmønster er medbestemmende for udviklingen af FXS.

PM er ustabil og kan ændres (ekspandere) fra generation til generation, men kun hos kvinder kan den ekspandere til FM hos afkommet, som dermed får FXS. Anlægsbærende mænd viderefører PM til alle døtrene, men får ikke børn med FXS. Forskellige skæringsværdier har været anvendt til definition af PM, da risikoen for ekspansion til FM afhænger både af repeat- antallet og repeat- sekvensen, idet enkelte adenin-guanin-guanin (AGG)-sekvenser kan stabilisere en CGG-repeat- sekvens. Således er stabiliteten af alleller med 40-60 repeats usikker; de befinder sig i den såkaldte gråzone. Der er imidlertid nu enighed om at definere PM som alleller med flere end 55-59 repeats (idet < 50 er normal, 50-58 er intermediær og 59-ca. 200 (umetyleret) er PM) som anbefalet af det europæiske kvalitetssikringsprogram European Molecular Quality Network (www.emqn.org).

Personer med PM er anlægsbærere og som hovedregel raske. Dog er der i de seneste år publiceret undersøgelser, hvis resultater viser, at mænd med PM har risiko for at få neurologiske symptomer efter 50-års-alderen, mens kvinder med PM kan have problemer med tidlig overgangsalder [6].

Teknologier til diagnostik og screening

Der er siden slutningen af 1970'erne blevet anvendt en cytogenetisk analyse. Denne kræver særlig dyrkning af kromosomerne, er tidskrævende, og man kan ikke påvise præmutationer med den. Efter opdagelsen af genet og den sygdomsforårsagende mutation i 1991, har de anvendte diagnostiske test næsten udelukkende været baseret på DNA-teknologier, nemlig Southern blot-analyse og polymerasekædereaktion (PCR)-analyse, hvor man med begge registrerer længden af CGG-repeats. (Figur 2 )

Southern blot-analyse detekterer såvel præmutationer som fulde mutationer og er guldstandard. En ulempe er, at den kræver ret store mængder af DNA, hvilket ofte vanskeligt kan opnås ved prænatal diagnostik. Desuden er metoden tids- og arbejdsresursekrævende med mindst en uges svartid.

PCR-metoden bruges til at kopiere og opformere (amplificere) den repeat- indeholdende del af FMR1- genet. Herved kan normale alleller og præmutationer op til en vis størrelse detekteres ved hjælp af gel-elektrofor ese eller kapillærelektroforese. Analysen er relativt hurtig, og mange prøver kan undersøges samtidig. Den kan imidlertid ikke bruges til at detektere fulde mutationer og store præmutationer, og specielt hos kvinder kan præmutationer vanskeligt amplificeres på grund af konkurrence fra den korte, normale allel. Endvidere kan man med analysen hos kvinder ikke skelne tilfælde med to normale alleller af samme størrelse (homozygote) fra tilfælde med en normal allel plus en stor PM (eller FM). PCR-metoden kan derfor anvendes som første metode, hvorefter man for de prøver, hvor resultaterne af ovennævnte grunde ikke kan fortolkes, yderligere må anvende Southern blot-analyse; resultaterne af tidligere undersøgelser viser, at der er behov for dette i ca. 20% af prøverne fra kvinder.

Man har forsøgt at udvikle PCR-baserede metoder, hvor man udnytter det forhold, at den fulde mutation medfører metylering af FMR1- genet, idet bisulfitbehandling modificerer metyleret og ikkemetyleret DNA forskelligt [7]. Metoderne er siden optimeret [8], men er komplicerede og ikke slået igennem som standard.

Der eksisterer således pålidelige, validerede metoder til DNA-diagnostik af sygdommen og anlægsbærerstatus, men en kombination af PCR- og Southern blot-metode er dog nødvendig for at påvise såvel normale forhold som præmutationer og fulde mutationer, hvilket er arbejdsmæssigt og tidsmæssigt resursekrævende. Der er for tiden ingen ideel hurtig, simpel og billig diagnostisk metode.

Forekomst af fragilt X-syndrom og præmutation i befolkningen
Forekomst af fragilt X-syndrom

Der er udført 42 studier i forskellige lande [3], hvor hyppigheden af FXS, påvist ved tilstedeværelsen af FM, er fundet at være til stede hos gennemsnitligt 2,3% af udviklingshæmmede drenge/mænd.

Tilsvarende er der udført 22 studier af hyppigheden af FXS hos udviklingshæmmede kvinder, og det blev fundet, at gennemsnitlig 0,7% af disse havde FM.

Hyppigheden af FXS i den generelle befolkning er estimeret indirekte i otte studier, hvor man på basis af undersøgelser af hyppigheden blandt udviklingshæmmede har relateret de fundne resultater til den samlede aldersmatchede population. Således estimeret er forekomsten i den generelle befolkning ca. en ud af 4.000 for mænd og ca. en ud af 8.000 for kvinder.

Direkte måling af FM i den generelle befolkning er kun udført i få og små materialer, hvor hyppigheden er fundet at være ca. 1,4 pr. 10.000, svarende til ca. en ud af 7.000. De mest omfattende undersøgelser er udført for kvinder, hvor frekvensen er 1,53 pr. 10.000, svarende til ca. en ud af 6.500.

Forekomst af PM

Der er publiceret 14 studier om forekomsten af PM hos kvinder og 16 om forekomsten hos mænd, alle udført i den generelle befolkning.

Som det bemærkes i [3], viser de senere studier en højere forekomst end de forudgående. Således var der i [1] rapporteret om en forekomst af PM hos kvinder på en ud af 273 og hos mænd på en ud af 800. I de senere undersøgelser viser de samlede data en forekomst på en ud af 149 kvinder og en ud af 643 mænd. Der kan være flere forklaringer på disse forskelle. For det første er der anvendt forskellige definitioner for PM, med skæringsværdier på 50-70 repeats; eksempelvis ligger 37% af alle PM på 50-55 repeats, hvorfor en øgning af afskæringsværdien fra 50 til 55 vil medføre et tilsvarende 37% fald i antallet af diagnosticerede PM. Der kan endvidere være tale om bias i de senere undersøgelser, for eksempel ved at slægtninge til personer, som tidligere er blevet diagnosticeret som anlægsbærere, vil have større tendens til at lade sig undersøge. Disse slægtninge må forventes at have en større hyppighed af PM end den generelle befolkning.

Forekomsten af PM er undersøgt hos danske drengebørn ved screening af 1.686 PKU-kort [9]. Der fandtes i alt tre PM, hvilket svarer til en PM pr. 562 drenge. Dette er i god overensstemmelse med de internationale opgørelser.

Risiko for ekspansion af præmutation til fuld mutation

Børn kan få FXS ved enten at arve en FM fra en mor med FM, eller ved at morens PM ekspanderer ved transmission. En mand med PM får ikke børn med FXS, da PM ikke ekspanderer til FM i den mandlige meiose.

I alt 14 studier [3] er publiceret om risikoen for, at en PM ekspanderer til FM, heraf var fire om risikoen i den generelle befolkning og ti om risikoen i FXS-familier.

Baseret alene på FXS-familier med tilsammen 1.111 transmissioner er den gennemsnitlige risiko for ekspansion ca. 63%. Risikoen for ekspansion til FM stiger dog med længden af PM og er således for en PM på over 100 repeats ca. 95%.

I de fire studier, som udgik fra screening af den generelle population, fandtes risikoen for ekspansion fra PM til FM at være 10%, altså betydelig mindre end i FXS-familierne, også for alleller med samme repeat- antal. For de store PM over 100 repeats er risikoen dog den samme som i familierne.

Årsagen til forskellen mellem FXS-familier og andre antages at være forskelle i DNA-sekvensen, idet enkelte AGG-sekvenser kan stabilisere en CGG-repeat- sekvens [9, 10]. Forskellen i risiko har selvsagt konsekvenser for rådgivning af FXS-familier og i forbindelse med screeningsprogrammer.

###48608b01###

Anlægsbærerscreening - forskellige aspekter
Danske erfaringer

I en opgørelse af fem års diagnostisk virksomhed på Kennedy Instituttet [11] blev der påvist 15 fuldmuterede blandt 697 udviklingshæmmede drenge, svarende til ca. 2,2%, hvilket er i overensstemmelse med det gennemsnit, der fandtes i de ovenfor nævnte internationale undersøgelser. Der er derfor grund til at tro, at forekomsten i Danmark svarer til de internationalt beregnede, og ud fra denne prævalens er der omkring 1.000 mennesker med FXS i Danmark. Vi kender omkring 300 patienter/familier, dvs. der er sandsynligvis endnu mange ikkediagnosticerede. Det er derfor overvejet at indføre screening for FXS-anlægsbærerstatus, og vi har igangsat et dansk pilotprojekt på anonymiseret materiale med henblik på at undersøge de praktiske og teknologiske aspekter, der er forbundet hermed.

Internationale erfaringer vedrørende tilslutning i befolkningen

Den mest anvendte strategi for anlægsbæreropsporing er såkaldt kaskadescreening, dvs. at så mange risikopersoner som muligt i en identificeret FXS-familie tilbydes testning. En anden mulighed er befolkningsscreening, enten som prænatal screening af gravide kvinder eller som neonatal screening.

Kaskadescreening i familier med FXS

Resultater af kaskadescreening er publiceret fra Australien, Finland og Holland [3]. Af de gravide anlægsbærende kvindelige slægtninge fik 78% i den australske undersøgelse [12] og alle i den finske undersøgelse [13] foretaget prænatal diagnostik (chorionvillusbiopsi). Graviditeten blev afbrudt i alle tilfælde med fuldmuterede drengefostre og i 60% af tilfældene med fuldmuterede pigefostre i den australske undersøgelse og i alle tilfælde i den finske undersøgelse. I den hollandske undersøgelse var accept af anlægsbærerscreening blandt slægtninge i FXS-familier 76% [14].

Prænatal screening

I [3] omtales fire studier, hvoraf der i tre fra Israel var tale om self-referrals, hvorfor det er vanskeligt at bedømme tilslutningen; alle graviditeter med påviste fuldmuterede fostre blev afbrudt. I et finsk studie var der tilslutning fra 85% af dem, der fik tilbuddet, og kvinder, der fik påvist PM, accepterede efterfølgende tilbud om prænatal diagnostik [15]; et fuldmuteret foster blev fundet, men graviditeten blev ikke afbrudt. I en nyligt publiceret opgørelse fra USA vedrørende tilbud om anlægsbærerscreening til 29.103 kvinder i en prænatal genetisk rådgivningsklinik fandt man, at 7,9% ønskede dette [16].

Der er således endnu kun få større befolkningsbaserede programmer med anlægsbærerscreening af gravide, hvilket gør det vanskeligt at sige noget sikkert om tilslutning. I familier med FXS er der stor tilslutning til screening hos slægtninge, og der synes også at være tilslutning til prænatal diagnostik.

Neonatal screening

Der foreligger ingen større undersøgelser heraf, og da der ikke er nogen kurativ behandling, er positive effekter af neonatal screening under alle omstændigheder diskutabel. Det kan dog påpeges, at man i påkommende tilfælde finder familien, inden barn nr. 2 bliver født, og genetisk rådgivning kan dermed tilbydes. Men da anlægsbærerne findes som børn, fratages de muligheden for senere at foretage et informeret valg. En gennemgang af praksis i Europa viste ikke anbefalinger af neonatal screening [17].

Effekten af screening

I den seneste HTA [3] har man i en simuleret model sammenlignet effekten af: 1) moderat kaskadescreening (i praksis det, der foregår i dag på de klinisk genetiske centre), 2) intensiv kaskadescreening, hvor man mere aktivt end hidtil opsøger FXS-tilfælde blandt udviklingshæmmede samt deres slægtninge og 3) prænatal screening. Effektmålet var en reduktion i antallet af børn født med FXS. Modellen viste, at prænatal screening (med en simuleret tilslutningsrate på 70%) må anses for at være klart den mest effektive.

Etiske aspekter

Formålet med et kaskade- eller prænatal screeningsprogram vil være at finde de kvinder, der har høj risiko for at få børn med FXS for at kunne tilbyde dem rådgivning angående fosterdiagnostik, således at kvinden får muligheden for at vælge graviditetsafbrydelse, hvis der påvises et fuldmuteret foster. Det er imidlertid vigtigt, at der før en evt. iværksættelse af screeningsprogrammer er ført en åben debat, hvor fordele og ulemper afvejes med inddragelse af etiske aspekter. Nedenfor peges på nogle emner, som har været til diskussion:

Ved prænatal screening er det et problem, at informationsniveauet i befolkningen vedrørende FXS er lavt, f.eks. set i forhold til den generelle viden om Downs syndrom. Det vil kræve meget betydelig rådgivning og udarbejdelse af informationsmateriale at sikre et reelt informeret samtykke. For eksempel vil man med DNA-analyse kunne påvise fuldmuterede pigefostre, hvoraf ca. halvdelen vil blive udviklingshæmmede og ca. halvdelen vil være normalt udviklede. Vordende forældre kan således ved diagnostik af fuldmuteret pige sættes i en vanskelig valgsituation. Som anført er repeat-antallet bestemmende for risikoen for, at der udvikles et fuldmuteret foster, og få repeats (50-70) medfører kun en lille risiko, hvorfor prænatal diagnostik måske ikke er ønskelig.

Ved kaskadescreening kommer informationspligten angående risiko for at være anlægsbærer til en vis grad til at påhvile familien selv. Effekten af kaskadescreening afhænger af, hvor stor en kreds man kan nå, men man vil som regel være tilbøjelig til at koncentrere sig om at informere den nærmeste familie. Der kan muligvis være risiko for stigmatisering ved anlægsbærerdiagnosen.

Konklusion

Det er et stort problem, at der efter vores beregninger er så mange udiagnosticerede FXS-tilfælde i Danmark. Ved forbedret opsporing kan der både opnås forbedret rådgivning vedrørende de socialpædagogiske tiltag, der kan iværksættes i forhold til patienterne, og flere kan få genetisk rådgivning om deres risiko for at få syge børn. Som led i diagnostisk udredning af gruppen af børn med indlæringsmæssige eller udviklingsmæssige problemer »screener« man for FXS i stor udstrækning i pædiatrisk regi, idet fragilt X-fænotypen er relativt uspecifik, især hos mindre børn, hvorfor det er nødvendigt, at det diagnostiske net er finmasket. Dette er i overensstemmelse med anbefalingen i et amerikansk referenceprogram, om at alle børn med generel udviklingsforsinkelse foruden en kromosomanalyse skal have foretaget undersøgelse for fragilt X [18].

Indsatsen bør formentlig fremover ligge her. Screening af gravide kan overvejes, især når/hvis de diagnostiske metoder bliver hurtigere og mindre resursekrævende.

Jens Vuust, Statens Serum Institut, DK-2300 København S. E-mail: jv@ssi.dk

Antaget: 22. januar 2006

Interessekonflikter: Ingen angivet

En meget omfattende litteraturliste findes desuden i [3]

Taksigelse: Arbejdet har været støttet af Helsefonden (Bev. Nr. 2000B522) og Statens Sundhedsvidenskabelige forskningsråd (Bev. Nr. 22-00-1153)

1. Murray J, Cuckle H, Taylor G et al. Screening for fragile X syndrome. Health Technol Assess 1997;1:1-69.
2. Pembrey ME, Barnicoat AJ, Carmichael B et al. An assessment of screening strategies for fragile X syndrome in the UK. Health Technol Assess 2001;5:1-95.
3. Song FJ, Barton P, Sleightholme V et al. Screening for fragile X syndrome: a literature review and modelling study. Health Technol Assess 2003;7:1-115.
4. Verkerk, AJ, Pieretti, M, Sutcliffe, JS et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell 1991;65:905-14.
5. Bardoni B, Mandel JL, Fisch GS. FMR1 gene and fragile X syndrome. Am J Med Genet 2000;97:153-63.
6. Hagerman PJ, Hagerman RJ. The fragile X premutation- a maturing perspective. Am J Hum Genet 2004;74:805-16.
7. Oostra BA, Willemsen R. Diagnostic tests for fragile X syndrome. Expert Rev Mol Diagn 2001;1:226-32.
8. Zhou, Y, Law, H-Y, Boehm, CD et al. Robust Fragile X (CGG)n genotype classification using a methylation specific triple PCR assay. J Med Genet 2004; 41:e45.
9. Larsen LA, Armstrong JS, Gronskov K et al. Haplotype and AGG interspersion analysis of FMR1 (CGG)n alleles in the Danish population. Am J Med Genet 2000;93:99-106.
10. Kunst CB, Warren ST. Cryptic and polar variation of the fragile X repeat could result in predisposing normal alleles. Cell 1994;77:853-61.
11. Gronskov K, Hjalgrim H, Nielsen IM et al. Screening of the ARX gene in 682 retarded males. Eur J Hum Genet 2004;12:701-5.
12. Robinson H, Wake S, Wright F et al. Informed choice in fragile X syndrome and its effect on prevalence. Am J Med Genet 1996;64:198-202.
13. Ryynanen M, Kirkinen P, Mannermaa A et al. Carrier diagnosis of the fragile X syndrome - a challenge in antenatal clinics. Am J Obstet Gynecol 1995;172: 12