Styrkelse af laboratorier er et nyt element i den globale tuberkulosekontrolstrategi

Laboratorier er ofte de svage led i tuberkulose (tb)-kontrol-programmer globalt. Blandt de estimerede tilfælde af multiresistent (MDR) Mycobacterium tuberculosis, vurderer Verdenssundhedsorganisationen (WHO), at kun ca. 5% får sygdommen påvist ved undersøgelse af prøver fra et relevant sygdomsfocus [1]. Barrierer for laboratoriediagnostik inkluderer vanskelig transport af prøver og patienter, manglende laboratorier eller laboratorier uden relevante resurser såsom kvalitetssikret apparatur og reagenser samt trænet personale. I den globale plan for tb-kontrol i 2011-2015 anbefales nu en væsentlig styrkelse af laboratoriekomponenten i tb-kontrol-programmer og påvisning af tb-tilfælde ved dyrkning i de lande, hvor man har mulighed for det [2].

Trods etablering og udbygning af et netværk af såkaldte WHO supranational TB reference laboratories, et global laboratory initiative, en laboratory strengthening task force, offentliggørelse af international standards for TB care [3] og anbefalinger for modern TB laboratory services [4] er der stadig lang vej til universel adgang til laboratoriebaseret tb-diagnostik i verden. En blandt flere konsekvenser af dette er, at man i mange lande har ringe kendskab til udbredelsen af resistent M. tuberculosis, hvilket medfører øget smittetryk i samfundene med resistent M. tuberculosis, da den opstartede behandling ikke nødvendigvis er effektiv.

I Danmark giver centraliseret diagnostik med et rimeligt prøveantal mulighed for løbende at evaluere og eventuelt indføre nye metoder, og situationen er dermed ganske forskellig fra den, der kendes fra lavindkomstlande. I mange lande arbejdes der i øjeblikket på at centralisere diagnostikken.

På trods af udviklingen af nye teknikker har gamle metoder fortsat stor betydning i tb-diagnostikken. Med mikroskopi for syrefaste stave, der blev indført for over 100 år siden i Danmark, kan man identificere de patienter, der udskiller flest bakterier og anses for at være smittefarlige, og som derfor bør isoleres (Figur 1 ). Patienter med smittefarlig lunge-tb har - i forhold til patienter, der udskiller færre bakterier - en øget risiko for, at der udvikles resistens i løbet af behandlingen og/eller for at dø af sygdommen, og behandlingen af disse patienter bør således superviseres tæt.

En anden af de ældre teknikker, dyrkning for M. tuberculosis på selektive medier, evt. efter drab af andre mikroorganismer i prøven, er specielt afgørende for diagnostikken ved prøver med få bakterier, som det f.eks. er tilfældet ved ekstrapulmonal tb. Trods løbende metodeforbedringer er diagnostik af pædiatrisk tb, pleuritis og meningitis stadig vanskelig. Dyrkning er fortsat en forudsætning for resistensbestemmelse og for påvisning af levende bakterier i behandlingsforløbet og dermed for vurdering af behandlingseffekt.

Siden slutningen af 1980'erne er der udført talrige evalueringer af nukleinsyreamplifikationsteknikker som f.eks. polymerasekædereaktion (PCR) til initial påvisning af M. tuberculosis -kompleks. Ved disse metoder har der generelt været en lavere sensitivitet end ved dyrkning ved den fordeling af prøvemateriale mellem analysen og guldstandarden, som man på laboratorierne havde valgt til studierne [5]. Disse teknikker har derfor kun været et supplement til den indledende diagnostik.

I 2010 er der imidlertid blevet publiceret meget lovende resultater af en ny amplifikationsteknik [6]. Analysen har vist høj sensitivitet ved undersøgelse af store prøvevolumina og tre konsekutive prøver. Med analysen har man samtidig påvist mutationer, der medfører rifampicinresistens. Selvom disse resultater giver optimisme for fremtiden, skal prøverne fortsat dyrkes, for at man kan udføre resistensbestemmelse for øvrige førstevalgs- og evt. andetvalgsstoffer. Metoden kan - som andre amplifikationsteknikker - ikke anvendes til at monitorere behandling med, idet der ikke skelnes mellem døde og levende bakterier.

WHO igangsatte i 1994 et globalt projekt til overvågning af resistent M. tuberculosis [7]. Et væsentligt led i dette projekt var standardisering af metoder og blindtest af fremsendte isolater i laboratorierne. I de efterfølgende år forbedredes laboratoriernes evne til at udføre korrekte resistensbestemmelser for førstevalgsstoffer væsentligt, hvilket har været afgørende for validiteten af den globale overvågning af MDR M. tuberculosis (rifampicin- og isoniazidresistent M. tuberculosis ).

Nu er standardiseringen nået til andetvalgsstoffer, idet WHO har udsendt nye anbefalinger, som man i laboratorierne arbejder på at implementere [8]. Resistensbestemmelse for andetvalgsstoffer er basis for definitionen af ekstensiv resistent M. tuberculosis, som nu er defineret som multiresistent M. tuberculosis med yderligere resistens for et injicerbart stof (amikacin, kanamycin og/eller capreomycin) samt et fluoroquinolon.

Under tb-kombinationsbehandling kan der ofte opstå mistanke om nonadhærens, resistensudvikling, bivirkninger eller sygdom af anden genese, hvilket kan gøre det vanskeligt at vurdere behandlingseffekten.

I de seneste fem år er metoder til påvisning af mutationer, der medfører resistens for de vigtigste antituberkuløse stoffer - rifampicin og isoniazid - udviklet til brug på fremdyrkede bakterier. På Mykobakteriologisk Laboratorium er flere af disse metoder blevet evalueret, og man har påvist, at metoderne kan anvendes på såvel bakterieisolater som på primære prøver, såfremt der er et tilstrækkeligt antal bakterier i prøven (mikroskopipositiv) [9-11]. WHO er efterfølgende nået til samme konklusion, og metoderne anbefales nu globalt. Metoderne giver mulighed for at opnå resultater på blot to dage (opsættes p.t. ugentligt). I øjeblikket evalueres en tilsvarende analyse til påvisning af mutationer, der koder for etambutol-, fluoroquinolon- og/eller aminoglykocidresistens.

I laboratoriet arbejdes der endvidere på at opsætte en analyse til bestemmelse af plasmakoncentrationerne af førstevalgsstofferne. Denne analyse kan anvendes til dosisindstilling af medicin, og er særligt relevant ved behandlingssvigt, alvorlig komorbiditet so m f.eks. hiv eller alvorlige gastrointestinale eller metaboliske abnormaliteter.

Tb-smittekæder blev tidligere kortlagt i Danmark ved den såkaldte restriction fragment length polymorphism (RFLP)-metode. Det europæiske center for sygdomsforebyggelse og -kontrol (ECDC) og det tilsvarende amerikanske, Centers for Disease Control and Prevention, anbefaler nu i stedet en PCR-baseret metode mycobacteria interspersed repetitive units variable number of tandem repeats (MIRU-VNTR) til overvågning af smittekæder.

Ved MIRU-VNTR-analysen undersøger man antallet af gentagelser af et specifikt DNA-element på 24 loci i M. tuberculosis -kompleks-genomet (Figur 2 og Tabel 1 ). I Danmark anvendes den internationale navngivning, der kombinerer antallet af gentagelser på 15 loci efterfulgt af antallet af gentagelser på de sidste ni loci (f.eks. 1112-15, hvor 1112 koder for de første 15 loci og 15 koder for de sidste ni loci) [12]. Med denne metode har man samme mulighed for at skelne mellem smittekæder som med RFLP.

MIRU har som RFLP en række anvendelsesmuligheder, bl.a. i forbindelse med overvågning. Det tidligere RFLP-smittekæde-cluster 2 navngives ved MIRU-VNTR-analyse som 1112-15. Det er tidligere påvist, at patienterne i denne smittekæde diagnosticeres sent, og der er påvist en stigende andel danskere med denne smittekæde [13]. MIRU-VNTR-analyser for 2006-2010 og tidligere RFLP-analyser viser, at det absolutte antal patienter i denne smittekæde nu er på over 600 i perioden 1992-2010. I 1992 blev der påvist otte patienter, siden 2000 er der årligt påvist 32-54 patienter, der tilhører denne smittekæde.

MIRU anvendes tillige til kvalitetssikring, idet det er velkendt fra Danmark og andre lande, at der som led i prøvehåndteringen kan ske krydskontamination mellem patientprøver [14] eller prøveforbytning i hospitalsregi. Endelig benyttes MIRU-VNTR til europæisk overvågning af MDR M. tuberculosis, udredning af arbejdsbetinget eller nosokomiel smitte og til vurdering af, om patienter er reinficeret eller har reaktiveret tidligere sygdom.

Som led i de miljøundersøgelser, der udføres ved fund af tb, er der nu flere muligheder for påvisning af smitte. Mantoux' hudtest med tuberkulin kan nu erstattes eller suppleres med interferongammapåvisning af M. tuberculosis -infektion i blodprøver, der stimuleres med M. tuberculosis- specifikke antigener. Denne mulighed er specielt relevant i tilfælde, hvor der er tale om tidligere BCG-vaccinerede, da der ikke er krydsreaktion med antigener fra vaccinestammen. Analysen anbefales tillige før opstart af tumornekrosefaktor-alfa-inhibitor-behandling, der medfører stor risiko for progression til aktiv sygdom, hvis patienten er latent inficeret.

I fremtiden er det muligt, at hudtest kan foretages med de M. tuberculosis- specifikke antigener rdESAT6 og CFP-10, idet det første sikkerhedsstudie med frivillige forsøgspersoner blev gennemført med gode resultater [15].

Resultater fra rutinediagnostikken anvendes til den nationale og internationale afrapportering til hhv. Epidemiologisk Afdeling, Statens Serum Institut, og ECDC/WHO, idet laboratoriet fremsender kopisvar vedrørende nye patienter til Epidemiologisk Afdeling og gennemgår resultater for alle anmeldte patienter årligt med henblik på optimal afrapportering. Denne gennemgang har i de seneste år vist, at et ret stort antal patienter har smittefarlig lunge-tb ved diagnosen - et tegn på sen diagnostik og på, at den generelle opmærksomhed på tb kunne være større.

I 2010 blev et nyt nationalt tb-kontrol-program indført i Danmark. Programmet er udarbejdet i samarbejde mellem de relevante videnskabelige selskaber og Statens Serum Institut og er tilgængeligt på selskabernes og instituttets hjemmeside [16].

Vibeke Østergaard Thomsen , Mykobakteriologisk Laboratorium, Statens Serum Institut, Artillerivej 5, 2300 København S. E-mail: vot@ssi.dk

Antaget: 11. januar 2011

Interessekonflikter: ingen