Toll-like receptorer, nye behandlingsstrategier?

Toll-like receptorer (TLR) er en gruppe nyopdagde receptorer i det innate immunsystem, og de har vist sig at være det molekylære grundlag for den immunologiske aktivering. Opdagelsen af TLR har på afgørende vis øget forståelsen af immunsystemets rolle i sygdomspatologi og giver nu anledning til nye antimikrobielle behandlingsstrategier. Artiklen beskriver nuværende viden om TLR's funktion ved udvalgte infektioner, deres mulige rolle i inflammatorisk tarmsygdomsgenese og TLR's centrale position i patofysiologien ved endotoksisk shock, hvilket man forsøger at udnytte til behandling.

De seneste års immunologiske forskning har budt på afgørende opdagelser, som nu udfordrer tidligere immunologiske dogmer og introducerer nye anti-mikrobielle behandlingsstrategier. Immunsystemets kardinalegenskab er evnen til at skelne kroppens egne strukturer (selv) fra fremmede strukturer (nonselv) og aktiveres til destruktion af non-selv, hvis noget sådant trænger ind i kroppen.

Den immunologiske overvågning varetages af immunsystemets to dele. Det uspecifikke/innate immunsystem, som aktiveres momentant ved patogeners indtrængen i kroppen og det specifikt/adaptive immunsystem, der aktiveres senere i infektionsforløbet.

De eksakte aktiveringsmekanismer i det innate immunsystem har hidtil været ukendte, hvorfor man refererede til denne del af immunsystemet som uspecifik. Men opdagelsen af en gruppe immunologiske receptorer kaldet toll-like receptorer (TLR) har gjort det klart, at aktiveringsmekanismerne i det innate immunsystem i høj grad er specifikke, og at aktiveringen af den innate immunitet oftest, hvis ikke altid, er en forudsætning for aktivering af den adaptive immunitet. I dette perspektiv er de nyopdagede TLR det molekylære grundlag for den samlede immunologiske aktivering.

Opdagelsen af så fundamentale receptorer har ikke blot øget den immunfysiologiske indsigt, men også ført til revideret opfattelse af en række gammelkendte sygdommes patofysiologi. Endvidere har forskningen allerede ført til udvikling af et nyt og lovende farmakon til behandling af endotoksinshock.

I denne oversigt gives en kort introduktion til TLR, og nogle af de væsentligste fund i relation til infektionsmedicinske problemstillinger beskrives. Efterfølgende omtales TLR's mulige rolle ved inflammatoriske tarmsygdomme. Til sidst beskrives TLR's centrale rolle i patogenesen ved endotoksisk shock og den heraf følgende udvikling af eritoran, et farmakon, som tegner lovende til behandling af endotoksisk shock.

TLR i den immunologiske aktivering

TLR er transmembrane, immunologiske receptorer, hvoraf 11 humane (TLR1-TLR11) er beskrevet [1]. De udtrykkes hovedsageligt i cellerne fra det innate immunsystem, men er også velbeskrevne i epitel- og endotelceller, adipocytter og monocytter [1, 2]. TLR hører til gruppen af pattern recognition receptors, som genkender konserverede molekylære strukturer kaldet patogen associated molecular patterns (PAMP) [1].

PAMP er universelt kendetegnende for patogener og identiske for en lang række forskellige mikroorganismer. Ved at benytte sådan universelle non-selv-strukturer kan innate immunceller skelne et stort antal forskellige patogener fra selv ved hjælp af få receptorer (Tabel 1 ) [3]. Dette står i tydelig kontrast til de mekanismer, som kendes fra det adaptive immunsystem, hvor genetisk hypermutation under cellulær proliferation og betydeligt cellulært henfald forårsager den opnåede immunitet.

Stimulering af TLR fører via komplekse intracellulære signaleringsveje til cellulær aktivering med secernering af proinflammatoriske cytokiner, kemokiner og interferoner (IFN) samt til antigenpræsentation. På den måde aktiverer patogeners TLR-stimulation sandsynligvis det samlede immunologiske respons (Figur 1 ) [4].

Virusinfektioner

Vira er årsag til forskelligartede infektioner, som spænder fra godartede til livstruende. En vigtig del af patogenesen ved alvorlige virusinfektioner er udløst af uhensigtsmæssige immunologiske reaktioner, og øget forståelse af immunopatologien er derfor vigtig ved udvikling af behandling.

Respiratorisk syncytialvirus (RSV) er en hyppig og frygtet årsag til nedre luftvejsinfektioner hos neonatale. Infektionen er oftest mild, men enkelte får alvorlig bronkiolitis og pneumoni.

En vigtig virulensfaktor for RSV er F-protein, som er en in vitro-ligand for TLR4 [5]. Man har derfor studeret RSV-infektionen i en TLR4-defekt musemodel. Musene bærer imidlertid også en defekt i IL-12, hvilket har vanskeliggjort tolkningen af resultaterne [5]. Således fandt man i to studier et sværere sygdomsforløb hos TLR4/IL-12-defekte mus end hos kontrolmus. I det ene studie påviste man IL-12-defekten som værende årsagen, mens man i det andet fandt, at TLR4-defekten var årsagen [6, 7].

Mens de omtalte studier ikke gav entydigt svar på TLR4's rolle i RSV-infektion hos mus, har man i et studie med mennesker påvist involvering af TLR4 ved RSV-infektion [8]. I studiet blev det påvist, at to TLR4- single nucleotide polymorphisms (SNP), Asp299Gly og Thr399Ile, er associerede med den alvorlige RSV-manifestation. Man må derfor konstatere, at der findes evidens for, at TLR4 spiller en vigtig rolle ved RSV-infektion hos mennesker, mens betydningen hos mus er mere usikker.

Herpes simplex virus 1 og virus 2 (HSV-1 og HSV-2) er årsager til f.eks. herpes labialis, encefalitis og genitale infektioner. I to studier med mus har man undersøgt betydningen af TLR9-defekt ved infektion med HSV-1 [9] og HSV-2 [10]. I begge fandt man, at musenes dendritiske celler responderede på HSV via TLR9. Men ved in vivo-forsøg responderede såvel TLR9-defekte mus som kontrolmus på HSV-1-infektion, mens responset på HSV-2 hos TLR9-defekte mus var nedsat. Til sammenligning har man i et tredje studie undersøgt HSV-1-infektion i en murin model for encefalitis og fundet, at neonatale TLR2-defekte mus er resistente for HSV-1-infektionen [11]. Samlet må man således konkludere, at TLR9 sandsynligvis aktiveres af både HSV-1 og HSV-2 ved in vivo-infektion hos mus. Men mens TLR9 er afgørende for responset mod HSV-2, syntes TLR2 at være vigtig for responset mod HSV-1 [5].

Cytomegalovirus (CMV) er årsag til latente infektioner hos immunkompetente, men kan give alvorlige manifestationer, f.eks. CMV-pneumoni, hos immundefekte. I undersøgelser af det innate respons på CMV har man fokuseret på TLR3 [5]. I to studier har man påvist, at TLR3-defekte mus responderer dårligt på CMV-infektion, mens man i et tredje studie ikke kunne eftervise dette [12-14]. Trods dette misforhold betragtes TLR3 som værende involveret i responset på CMV, da man i det sidstnævnte studie ikke fokuserede på CMV-infektionen i detaljer [5].

Det er i øvrigt interessant, at man i in vitro-studier har påvist et TLR2 udløst respons på CMV-vioner [11]. Yderligere forskning i dette afventes.

TLR's rolle i den immunologiske aktivering gør det oplagt, at evolutionen har forsynet nogle mikroorganismer med funktioner, der hæmmer TLR-funktionen. Hepatitis C-virus (HCV), der er årsag til kroniske infektioner, koder for proteasen NS3-4A, som kan spalte proteiner i signalvejene for TLR [15]. Det kan være en af de mekanismer, der bidrager til etablering af den kroniske infektion [16]. En lignende mekanisme kendes hos koppevirus, der koder for to enzymer (A52R og N1L), som også interagerer med signaleringsvejene for TLR [17, 18]. I modsætning hertil har hiv udviklet mekanismer, som udnytter de mest centrale molekyler i signaleringsvejene for TLR i sin replikation. Man har i studier påvist, at stimulering af TLR2, TLR4 og TLR9 kan føre til øget hiv-replikering i mastceller [19] og i musemodeller [20]. Endvidere er det i kliniske studier vist, at koinfektion med HIV-1 og Mycobacterium tuberculosis medfører accelereret forløb af hiv-infektionen ved M. tuberculosis' stimulation af TLR2 [21].

Bakterielle infektioner

Bakterielle infektioner udgør hyppige kliniske problemstillinger, hvis manifestationer spænder fra selvlimiterende til hyperakutte. Ofte skyldes en væsentlig del af patogenesen ved de akutte infektioner et uhensigtsmæssigt immunologisk respons. Forståelsen af den immunologiske aktivering er derfor vigtig i forsøget på at behandle sådanne infektioner.

Bakterier opdeles traditionelt i grampositive (G-p) og gramnegative (G-n). G-p-bakteriers modtagelighed ved gramfarvning skyldes et højt indhold af peptidoglycan (PGN) i cellevæggen, mens G-n-bakteriers membran er karakteriseret ved et højt indhold af lipopolysakkarid (LPS).

I udforskningen af den immunologiske aktivering ved G-p-infektioner har man derfor fokuseret på TLR2, som er receptor for PGN, mens man i forskningen i G-n-infektioner har fokuseret på TLR4, som er receptor for LPS (Tabel 1).

Staphylococcus aureus er en velkendt G-p-kok, der er årsag til forskelligartede infektioner. I et musestudium af S. aureus- infektion har man sammenlignet betydningen af en defekt TLR2-receptor med betydningen af defekt i et koblingsprotein, som er nødvendigt for funktionen af alle TLR [22]. Ved intravenøs infektion med højdosis S. aureus havde musene i begge grupper signifikant højere mortalitet end kontrolmusene. Men ved infektion med lavdosis S. aureus havde TLR2-defekte mus samme mortalitet som kontrolmus, mens musene med det defekte koblingsprotein havde øget mortalitet i forhold til kontrolmusene. Det indikerer altså, at TLR2 er aktiv ved S. aureus- infektion, men at andre TLR også er involverede.

S. pneumoniae er årsag til f.eks. pneumoni og meningitis. I et musestudie har man undersøgt TLR2's rolle i det immunologiske respons ved S. pneumoniae- meningitis og fundet øget mortalitet hos TLR2-defekte mus sammenlignet med hos kontrolmus selv under ceftriaxonbehandling af de TLR2-defekte mus [23]. I et andet studium har man undersøgt TLR4's rolle ved S. pneumoniae- induceret pneumoni og fundet øget mortalitet hos TLR4-defekte mus sammenlignet med kontrolmus [24]. Det er uafklaret, om både TLR2 og TLR4 er involveret i genkendelsen af S. penumoniae in vivo, eller om forskellen skyldes forsøgsdesign.

Salmonella enterica serovar Typhimurium ( S. Typhimurium) er en G-n, flagellatstav, som forårsager akut gastroenteritis, og kan give alvorlige sequelae. I flere studier har man undersøgt S. Typhimurium-infektionen i musemodeller med defekt i forskellige dele af TLR4-receptoren. Helt summarisk fandt man i flere studier øget mortalitet blandt TLR4-defekte mus end blandt kontrolmus efter intraperitoneal infektion med S. Typhimurium [25]. Men i et enkelt studie, hvor S. Typhimurium-infektion ad den naturlige orale rute blev undersøgt, fandt man ingen forskel i mortaliteten mellem TLR4-defekte mus og kontrolmus [26]. Årsagen til dette er endnu ikke klarlagt.

Escherichia coli er en anden G-n stav, som er årsag til f.eks. urinvejsinfektioner (UVI) og sepsis. Studier af E. coli- induceret UVI har givet vigtig information om epitelets rolle i den immunologiske aktivering in vivo. Ved intrauretral infektion med E. coli hos TLR4-defekte mus er der påvist et manglende inflammatorisk respons, som gør, at musene ikke clearer infektionen [25]. Ved at knoglemarvstransplantere musene med TLR4-udtrykkende stamceller genoprettes TLR4-ekspressionen på immunologiske celler, men ikke på epitelet. En sådan knoglemarvstransplantation restituerer kun det inflammatoriske respons delvist, og dermed er det sandsynliggjort, at epiteliale celler medvirker i dannelsen af det antiinfektiøse forsvar [27].

Legionella pneumophila er en flagellat, G-n bakterie, som er årsag til legionærsyge. I en menneskepopulation har man fundet en SNP i TLR5 (392Stop), som giver anledning til et stopcodon i og dermed tab af funktionel TLR5 [28]. I studiet påviste man, at denne SNP giver øget modtagelighed for legionærsyge, og påviser TLR5's betydning i immunresponset hos mennesker.

Inflammatorisk tarmsygdom og TLR

Inflammatoriske tarmsygdomme er karakteriserede ved en kontinuerlig ulcerativ inflammation i tarmen præget af periodisk aktivitet [29]. På cellulært niveau kendetegnes sygdommene af høj aktivitet i en række intracellulære signaleringsmolekyler, som er identiske med molekyler i signaleringsvejene for TLR [29]. Det er således fristende at forestille sig en sammenhæng mellem TLR og inflammatorisk tarmsygdom. Forekomsten af den naturlige tarmflora, der karakteriseres af samme PAMP som patogene tarmbakterier, stiller i den kontekst særlige krav til TLR-funktionen i tarmen, der skal udvise tolerans for den naturlige tarmflora, men aktiveres ved infektion. I nuværende hypoteser for mekanismerne bag denne tolerans peger man på subcellulær distribution af TLR og ekspression af TLR-antagonister som centrale elementer i dens opretholdelse (Figur 2 ). Ligeledes peger resultaterne af såvel eksperimentelle som kliniske studier på, at svigt i disse mekanismer er medvirkende årsag til inflammatorisk tarmsygdom.

I et studie har man fundet øget TLR4-ekspressionen i colonvæv fra patienter med morbus Crohn (MC) og colitis ulcerosa (CU) [30]. I overensst emmelse hermed har man i to studier påvist korrelation mellem TLR4-SNP og udviklingen af MC og CU [30]. Undersøgelser af colonvæv fra CU-patienter har vist nedreguleret aktivitet af en vigtig TLR-antagonist [31]. Der er også evidens for involvering af TLR5 ved MB. I et studie har man i serum hos MB-patienter påvist antistoffer mod flagellin, afledt fra bakterier tilhørende den normale tarmflora [32]. Man fandt yderligere, at antistoftiteren kunne korreleres med graden af tarminflammation i en musemodel.

Samlet set indikerer ovenstående altså et element af TLR-dysfunktion i inflammatoriske tarmsygdommes patogenese. Men der findes også evidens for, at TLR kan indgå i tarmbeskyttende effekter.

Probiotika er bakteriestammer med gunstige effekter i tarmen, bl.a. beskytter de mod MB og CU [33]. I et studie har man i en musemodel for colitis påvist, at TLR9-defekte mus ikke har samme beskyttende effekt af probiotika som kontrolmus, og endvidere at de beskyttende effekter skyldes DsDNA fra probiotika, som netop er PAMP for TLR9 [34]. Dette støttes af et andet studie, hvori man har fundet signifikant association mellem en SNP i TLR9 og MC [32].

Der tegner sig altså et komplekst billede af TLR's funktioner i tarmepitelet. Yderligere forskning på området vil forhåbentlig udvide og forbedre vores muligheder i behandlingen af inflammatoriske tarmsygdomme.

Gramnegativ sepsis, endotoksinshock og eritoran

LPS er PAMP for TLR4 og det kausative agens ved endotoksinshock, det fuldt udviklede forløb af G-n sepsis. Det kliniske billede præges af intravaskulær koagulation, ødemer, hypotension og nedsat organoperfusion, hvilket leder til multiorgansvigt (Figur 3 ) [35].

I tidlige undersøgelser har man påvist, at mus med defekter i TLR4-receptoren var hyporesponsive for LPS [36, 37]. Senere fandt man yderligere korrelation mellem flere SNP i TLR4 og såvel incidensen som mortaliteten af endotoksinshock hos mennesker [37]. Forståelsen af TLR4's rolle i patogenesen ved endotoksinshock førte til forsøg med at fremstille stoffer, som kan blokere LPS's aktivering af TLR4. Til formålet isolerede og modificerede man en del af LPS fra Rhodobacter capsulatus og R. sphaeroides, som har potente LPS-antagonistiske egenskaber [38]. Den fremstillede antagonist (eritoran) har vist meget lovende resultater i fase I-forsøg. Stoffet tåles således af forsøgspersoner og blokerer LPS-induceret TNF-α -frigivelse i fuldblod udtaget fra forsøgspersonerne efter eritoraninfusion [39].

Næste skridt har været at teste eritoran i en endotoksinmodel hos mennesker, hvor der indgives en lille mængde endotoksinopløsning til forsøgspersonerne. Normalt fremkalder det kliniske symptomer og paraklinisk stigning i serum IL-6, TNF-α og C-reaktivt protein (CRP) [38]. Men når disse personer modtager eritoraninfusion, blokeres de kliniske symptomer, og samtidig reduceres IL-6 og TNF-α -frigivelsen mere end 99%, mens CRP-stigningen reduceres med mere end 91% [40]. På baggrund af ovenstående forsøg er eritoran nu overgået til kliniske fase II-studier. Resultaterne af disse undersøgelser afventes stadig.

Konklusion

Opdagelsen og udforskningen af TLR har på afgørende vis øget indsigten i immunologiske aktiveringsmekanismer. Det er således blevet klart, at den innate immunitet er særdeles specifik, og at aktiveringen af det samlede immunsystem er tættere forbundet end tidligere antaget. Den øgede forståelse af de immunologiske aktiveringsmekanismer indeholder potentialet til, at kunne manipulere immunologisk over- og underreaktion, som er en væsentlig del af patogenesen ved en lang række sygdomme. Således har man allerede udviklet eritoran, som repræsenterer en ny tankegang inden for antimikrobiel terapi, der bygger på indgriben i interaktionen mellem mikroorganisme og immunsystem i stedet for i mikrobielle metaboliske processer. Den øgede forståelse for immunologiske aktiveringsmekanismer har også givet muligheden for at betragte og måske på længere sigt behandle gammelkendte sygdomme som inflammatorisk tarmsygdom ud fra et nyt perspektiv. Således betyder den rivende udvikling på det beskrevne område, at vi i fremtiden sandsynligvis vil se en række nye behandlinger rettet specifikt mod disse receptorer eller deres signaleringsveje.

Claus Vinter Bødker Pedersen, Infektionsmedicinsk Forskningslaboratorium, Afdeling Q, Århus Universitetshospital, Skejby, DK-8200 Århus N. E-mail: claus_vinter@hotmail.com

Antaget: 30. oktober 2006

Interessekonflikter: Ingen angivet

1. Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors. Annu Rev Immunol 2003; 21:335-76.
2. Basset C, Holton J, O'Mahony R et al. Innate immunity and pathogen-host interaction. Vaccine 2003;21(suppl 2):S12-23.
3. Hallman M, Ramet M, Ezekowitz RA. Toll-like receptors as sensors of pathogens. Pediatr Res 2001;50:315-21.
4. Blach-Olszewska Z. Innate immunity: cells, receptors, and signaling pathways. Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 2005;53:245-53.
5. Mogensen TH, Paludan SR. Reading the viral signature by toll-like receptors and other pattern recognition receptors. J Mol Med 2005;83:180-92.
6. Haynes LM, Moore DD, Kurt-Jones EA et al. Involvement of toll-like receptor 4 in innate immunity to respiratory syncytial virus. J Virol 2001;75:10730-7.
7. Ehl S, Bischoff R, Ostler T et al. The role of toll-like receptor 4 versus interleukin-12 in immunity to respiratory syncytial virus. Eur J Immunol 2004; 34:1146-53.
8. Tal G MA, Dalal I, Cesar K et al. Association between common toll-like receptor 4 mutations and severe respiratory syncytial virus disease. J Infect Dis 2004;189:2057-63.
9. Krug A, Luker GD, Barchet W et al. Herpes simplex virus type 1 activates murine natural interferon-producing cells through toll-like receptor 9. Blood 2004;103:1433-7.
10. Lund J, Sato A, Akira S et al. Toll-like receptor 9-mediated recognition of Herpes simplex virus-2 by plasmacytoid dendritic cells. J Exp Med 2003; 198:513-20.
11. Kurt-Jones EA, Chan M, Zhou S et al. Herpes simplex virus 1 interaction with Toll-like receptor 2 contributes to lethal encephalitis. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:1315-20.
12. Hoebe K, Du X, Georgel P et al. Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88-independent TIR signalling. Nature 2003;424:743-8.
13. Tabeta K, Georgel P, Janssen E et al. Toll-like receptors 9 and 3 as essential components of innate immune defense against mouse cytomegalovirus infection. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:3516-21.
14. Edelmann KH, Richardson-Burns S, A