Transportproteiner som drug-targets hos Plasmodium falciparum

Malariaparasitten inficerer og formerer sig i erytrocytter. Af de fire humanpatogene arter er Plasmodium falciparum langt den farligste, hvilket skyldes en kombination af hurtigt progredierende parasitæmi hos nonimmune individer og de parasitholdige erytrocytters evne til at adhærere til endotelet i blodkarrene i de indre organer. I kombination med en løbende resistensudvikling hos parasitten over for de malariamidler, der anvendes, gør det P. falciparum til den altdominerende årsag til malariadødeligheden i udviklingslandene, og WHO anslår i 2005, at mindst en million mennesker, primært børn under fem år i tropisk Afrika, hvert år dør af sygdommen. Der er derfor et stort behov for en løbende udvikling af nye antimalariamidler.

Mulige mål for fremtidig antimalariaterapi skal måske findes i de transportfunktioner, som parasitten anvender [1]. Der gives i nærværende artikel først en kort gennemgang af de ændringer, som infektionen medfører i erytrocyttens cellemembran, og dernæst beskrives de af malariaparasittens transportproteiner, som kan tænkes at være potentielle drug targets.

Ændringer i erytrocytcellemembranens transportkarakteristika

Den mature humane erytrocyt er en relativt simpel og metabolisk set temmelig inaktiv celle. Bortset fra udvekslingen af kuldioxid og oxygen er cellemembranens eneste funktion at opretholde et konstant volumen, hvilket blandt andet afspejles i lave membranpermeabiliteter for K+ og Na+. Erytrocytten optager glukose ved faciliteret diffusion via GLUT1, og selv om der ikke foregår DNA-replikation i den humane erytrocyt, kan den som andre humane celler optage fysiologiske D-nukleosider ved faciliteret diffusion.

Ved infektion med P. falciparum inducerer parasitten nye transportveje, de såkaldte new permeation pathways (NPP) i erytrocyttens cellemembran [2] (Figur 1). Disse kanaler er permeable for en lang række ioner og kolloider, som ikke passerer den normale erytrocyts cellemembran. Selv om NPP minder om kloridkanaler, tillader de i et vist omfang passage af kationer, og erytrocyttens koncentrationsgradienter for K+ og Na+ kollapser i løbet af parasittens 48-timers-cyklus. Lidt forsimplet kan man sige, at erytrocytten omdannes til en slags »hyttefad«. Erytrocyttens hullede cellemembran sikrer parasitten et passende nærmiljø med fri passage af nærings- og affaldsstoffer og yder samtidig beskyttelse mod værtsorganismens immunsystem.

Farmakologisk blokade af NPP er teoretisk set en effektiv strategi i behandling af malaria. Derved vil parasitten gå til grunde på grund af ophobning af egne affaldsprodukter. I praksis er de farmakologiske inhibitorer af NPP, som er iden-tificeret, temmelig uspecifikke og lavpotente, og de påvirker også humane transportproteiner. For eksempel kan det velkendte loopdiuretikum furosemid både blokere NPP og hæmme væksten af P. falciparum i blodkultur, men kun i koncentrationer, som ikke er klinisk relevante. En anden strategi kunne derfor være at udvikle lægemidler, som kun kunne passere de inficerede erytrocytters NPP. Eksempelvis kan både D-nukleosider (fysiologiske) og L-nukleosider (non-fysiologiske) passere NPP, mens kun D-nukleosider kan passere den normale erytrocyts cellemembran. Ved selektiv optagelse af toksiske L-nukleosider i inficerede erytrocytter kunne parasitternes DNA-replikation hæmmes. Eventuelt kunne man koble et velkendt antimalariamiddel til et L-nukleosid og derved opnå en opkoncentrering af det virksomme stof i de inficerede erytrocytter [3].

Transportproteiner i P. falciparums cellemembran

Parasittens cellemembran er bestykket med en række specifikke transportproteiner, som tillader P. falciparum en differentieret optagelse af substanser fra værtscellens cytoplasma. Med sekventeringen af P. falciparums 23 Mb store genom [4] er det blevet muligt at foretage en systematisk gennemgang af disse transportproteiner, og flere af dem er klonet og karakteriseret funktionelt i heterologe ekspressionssystemer (celletyper, der kan udtrykke værtsfremmed protein). I Tabel 1 findes en oversigt over udvalgte transportproteiner fra P. falciparum sammen med en angivelse af deres funktion.

P. falciparum-transportproteiner med betydning for metabolisme

P. falciparums stofskifte er udelukkende baseret på glykolyse, og parasitten er afhængig af et konstant og meget stort glukoseoptag fra erytrocyttens cytoplasma. Erytrocyttens egen glukosetransporter, GLUT1, har tilstrækkelig kapacitet til at forsyne parasitten også, og fra erytrocyttens cytoplasma optages glukosen i parasitten ved faciliteret diffusion via en hexosetransporter, P. falciparum hexose transporter 1 (PfHT1) ( Figur 1). Funktionelt adskiller PfHT1 sig fra humane glukosetransportere ved en bredere substratprofil, og der er syntetiseret en gruppe af glukoseanaloger, som tillader selektiv inhibition af P. falciparums glukoseoptagelse (og vækst), uden at erytrocyttens glukosetransportere GLUT1 og GLUT5 påvirkes i væsentligt omfang. Disse glukoseanaloger hæmmer både væksten af P. falciparum i blodkultur og væksten af gnaver-malariaparasitten P. yoelii i en dyremodel. PfHT1 er derfor indtil videre det bedste bud på et transportprotein som et potentielt drug target i P. falciparum [5].

I modsætning til humane celler kan P. falciparum ikke syntetisere purinbaser (adenin og guanin), hvorfor parasitten må genbruge og/eller optage nukleosider fra erytrocyttens cytoplasma. Som omtalt tidligere kan den normale erytrocyt optage D-nukleosider fra plasmaet ved faciliteret diffusion, mens de parasitinducerede NPP er permeable både for D- og L-nu-kleosider. Den videre transport af nukleosider over parasittens cellemembran foregår via en nukleosidtransporter (PfENT1 [6] eller PfNT1 [7], P. falciparum (equilibrative) nucleoside transporter 1). Funktionelt er Pf(E)NT1 ikke selektiv for de fysiologiske D-puriner, men tillader i m odsætning til de humane nukleosidtransportere hENT1 og hENT2 også passage af L-puriner og visse klinisk anvendte antivirale nukleosidanaloger. Samtidig er Pf(E)NT1 relativt ufølsom over for inhibitorer af humane nukleosidtransportere. Forventningen er, at disse forskelle mellem Pf(E)NT1 og de humane nukleosid-transporter vil kunne udnyttes farmakologisk til en målrettet antimalariaterapi.

P. falciparum-transportproteiner med betydning for volumenregulering og calciumstofskifte

Som andre levende celler søger malariaparasitten at opretholde et konstant volumen. Det forudsætter blandt andet fungerende vandkanaler i parasittens cellemembran. Parasittens vandkanal PfAQP (P. falciparum Aquaporin) tilhører de såkaldte aquaglyceroporiner, som også tillader passage af mindre organiske molekyler (Figur 1). Årsagen er formentlig, at PfAQP deltager i andet end blot vandtransport. Replikation af parasitten forudsætter rigelige mængder glycerol til lipidbiosyntese, og her kan aquaporinet antagelig spille en vigtig rolle, idet glycerol kan optages fra erytrocyttens cytoplasma via PfAQP. Samtidig er parasitten udsat for store ændringer i osmolaritet, især i forbindelse med de inficerede erytrocytters passage gennem nyrens blodkar. PfAQP vil her med sin permeabilitet for små organiske molekyler kunne bidrage til en hurtig volumenregulering. På grund af en ganske anderledes aminosyresekvens i poreregionen for PfAQP i forhold til i humane aquaporiner [8] har PfAQP en anden farmakologisk profil med hensyn til inhibition, og det åbner muligheden for selektiv inhibition af PfAQP. Endelig vil PfAQP kunne benyttes som drug route. For eksempel kan det antineoplastiske medikament hydroksurea optages gennem PfAQP, og hos en anden protozo, Leishmania major, sker optagelsen af klinisk anvendte antiparasitære antimonforbindelser gennem et tilsvarende aquaporin.

En anden vigtig faktor i regulering af cellevolumen og membranpotentiale er K+-kanaler. Der er fra P. falciparum klonet en K+-kanal, som har en helt anderledes aminosyresekvens i poreregionen end humane K+-kanaler [9]. Kanalen er endnu ikke karakteriseret funktionelt. Når det sker, vil der være et bredt sortiment af farmaka at afprøve. Medicinalindustrien har i mange år arbejdet med at udvikle lægemidler, som påvirker K+-kanaler. Baggrunden er, at K+-kanaler spiller en central rolle for regulering af cellers membranpotentialer, hvilket har betydning ved lidelser i blandt andet hjerte og hjerne. De fleste antiarrytmika inhiberer således de kardiale K+-kanaler, som medvirker ved hjertemuskelcellernes repolarisering. Antiarrytmika vil af samme grund selvsagt ikke kunne anvendes direkte i behandlingen af malaria, medmindre stofferne modificeres kemisk, så de virker specifikt på malariaparasittens K+-kanal, det vil sige uden at påvirke humane K+-kanaler.

Afslutningsvis bør det nævnes, at parasitten besidder en Ca2+-ATPase, som minder meget om den Ca2+-pumpe, der kontrollerer den cytoplasmatiske Ca2+-koncentration i skeletmuskulatur. Denne Ca2+-ATPase (PfATP6) medvirker til at opretholde en lav koncentrationen af Ca2+ i parasittens cytoplasma, og den blokeres specifikt og potent af det effektive antimalariamiddel artemisinin, som samtidig ikke påvirker muskelcellers Ca2+-homøostase [10] (Figur 1). Om det er den eneste forklaring på artemisinins effekt over for P. falciparum in vivo, er ikke fuldt belyst, men eksemplet fremhæver transportproteinernes potentiale som drug targets.

Konklusion

P. falciparums vækst og replikation i den humane erytrocyt er afhængig af en række fungerende transportproteiner i parasittens cellemembran. Med publiceringen af P. falciparums genom, er det blevet muligt at studere disse transportproteiner på systematisk vis. Malariaparasittens transportproteiner adskiller sig i flere tilfælde markant fra de tilsvarende proteiner hos mennesket. Blandt andet er malariaparasittens hexosetransportør et potentielt mål for antimalariaterapi. Hvis specifikke og potente inhibitorer af malariaparasittens transportproteiner syntetiseres, vil det være et gennembrud i bekæmpelsen af en af de alvorligste infektionssygdomme i verden.

Se også artiklen ”Økonomisk kur mod malaria?” fra Ugeskrift for Læger nr. 11.

<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /???>

 
Peter Ellekvist, Medicinsk Fysiologisk Institut, Panum Instituttet, Blegdamsvej 3, DK-2200 Købehavn N. E-mail: ellekvist@immi.ku.dk

Antaget: 18. juli 2005

Interessekonflikter: Ingen angivet

Taksigelser. Arbejdet er udført med støtte fra Danida, Fonden til Lægevidenskabens Fremme, Københavns Universitets Lægevidenskabelige Forskningsfond og Afdelingen for Forskning og Lægevidenskabelig Uddannelse, Sønderborg Sygehus.

1. Kirk K. Channels and transporters as drug targets in the Plasmodium-infected erythrocyte. Acta Trop 2004;89:285-98.
2. Kirk K. Membrane transport in the malaria-infected erythrocyte. Physiol Rev 2001;81:495-537.
3. Gero AM, Dunn CG, Brown DM et al. New malaria chemotherapy developed by utilization of a unique parasite transport system. Curr Pharm Des 2003;9: 867-77.
4. Gardner MJ, Hall N, Fung E et al. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Nature 2002;419:498-511.
5. Joet T, Krishna S. The hexose transporter of Plasmodium falciparum is a worthy drug target. Acta Trop 2004;89:371-4.
6. Parker MD, Hyde RJ, Yao S Y, et al. Identification of a nucleoside/nucleobase transporter from Plasmodium falciparum, a novel target for anti-malarial chemotherapy. Biochem J 2000;349:67-75.
7. Carter NS, Ben Mamoun C, Liu W, et al. Isolation and functional character-ization of the PfNT1 nucleoside transporter gene from Plasmodium falciparum. J Biol Chem 2000;275:10683-91.
8. Beitz E. Aquaporins from pathogenic protozoan parasites: structure, function and potential for chemotherapy. Biol Cell 2005;97:373-83.
9. Ellekvist P, Ricke CH, Litman T, et al. Molecular cloning of a K+ channel from the malaria parasite Plasmodium falciparum. Biochem Biophys Res Commun 2004;318:477-84.
10. Eckstein-Ludwig U, Webb RJ, Van G, et al. Artemisinins target the SERCA of Plasmodium falciparum. Nature 2003;424:957-61.