Virale vektorer til klinisk genterapi

De første positive kliniske resultater af genterapeutiske behandlingsforsøg har nu vist sig, og på baggrund af disse relativt få positive resultater og de endnu flere resultatløse forsøg er det muligt at danne sig et indtryk af, hvor problemerne og udviklingsmulighederne findes. De største van-skeligheder har vist sig at stamme fra de virale vektorer, der skal overføre terapeutiske gener. De fleste vellykkede genterapeutiske forsøg er gennemført ved monogenetiske sygdomme, hvor det relevante væv har kunnet isoleres ex vivo, og hvor en retroviral vektor har indsat det terapeutiske gen i det nukleære DNA. Genterapi synes at have et klart behandlingspotentiale over for en række sjældne, arvelige sygdomme og visse erhvervede sygdomme såsom iskæmisk hjertesygdom.

Genterapi har i flere år været nævnt som en meget lovende teknologi, der kunne revolutionere den medicinske behandling af en lang række medfødte og erhvervede sygdomme. Siden de første delvist positive resultater med svær kombineret immundefekt (SCID)-børn i begyndelsen af 1990'erne (1) er der gennemført flere hundrede mindre, kliniske forsøg. Resultaterne har dog indtil for nylig ikke været slående. Vanskelighederne har især vist sig at stamme fra de anvendte vektorer til overførsel af terapeutiske gener (2). Disse vektorer har i langt overvejende grad været modificerede virus, især retrovirus, som i de første udgaver blot var replikationsinkompetente murine retrovirus. Det viste sig imidlertid hurtigt, at virale vektorer var mere komplicerede end først antaget, og problemerne med de virale vektorer har været den afgørende blokering for klinisk anvendelse af genterapi. Disse problemer er nu ved at blive løst, og de seneste ti års molekylærvirologiske forskning har frembragt en række nye vektorer (3), som dels løser nogle af de specifikke problemer ved de gamle vektorer, dels er helt nye vektorsystemer, der er baserede på andre principper eller andre virus end for ti år siden (Tabel 1 ).

I denne artikel gives der en oversigt over de klinisk anvendte genterapivektorer, de vanskeligheder - og bud på løsninger - der endnu står tilbage, og de helt nye vektorer, som er på vej. Det er disse forhold, som vil være afgørende for, hvilke sygdomme der lader sig behandle med succes, og det er fremstillingen og håndteringen af vektorerne, der stiller de største udfordringer til det danske sundhedsvæsen, hvis de genterapeutiske behandlingstilbud, der nu er under etablering i udlandet, også skal tilbydes herhjemme.

Vævsspecificitet

Den første vigtige opgave for en vektor til overførsel af terapeutisk genmateriale er, at overførslen sker til det relevante væv. Virus er naturlige overførselsvektorer, og deres naturlige vævsspecificitet (tropisme) er efterhånden kendt i de fleste tilfælde. Når den genterapeutiske strategi baserer sig på ex vivo-overførsel, dvs. når vævet - typisk lymfocytter eller hæmatopoietiske stamceller - kan isoleres fra patienten og håndteres i et laboratorium, har man anvendt virale vektorer med bred specificitet. Vektorer, der er baserede på amfotrope murine retrovirus, binder sig til receptorer fx RAM1, der forekommer almindeligt på celler hos mennesker, og adenoassocieret virus (AAV) binder sig også til almindeligt forekommende receptorer, heparansulfat og α Vβ 5-integrin. Selv om disse receptorer er almindelige, så er ekspressionen dog ikke altid ubikvitær eller tilstrækkelig høj til en terapeutisk tilfredsstillende viral genoverførsel (transduktion). Endnu bredere tropisme kan dog opnås ved at pseudotyperetrovirale vektorer, evt. de lentivirale hiv-1 eller felint immundeficit virus (FIV), med overfladeglykoproteinet fra vesikulær stomatitvirus og de lentivirale vektorer vil tillade transduktion af også ikke-delende celler såsom stamceller (4).

Bred tropisme er nyttig, når det relevante væv er isoleret ex vivo. Bred tropisme kan derimod være et problem, hvis den genterapeutiske strategi er baseret på in vivo-overførsel af det genetiske materiale, især hvis der er tale om systemisk brug af vektoren. Almindelig i.v. injektion af en amfotrop retroviral vektor med det formål at overføre et terapeutisk gen til fx cancermetastaser vil medføre, at vektorpartiklerne optages af irrelevante celler, længe inden de når frem til cancervævet. Bred tropisme kan også beskrives som manglende selektivitet, og bortset fra at dette giver problemer med at få vektormaterialet frem til det relevante væv, betyder det også, at der er en risiko for, at normalt væv, herunder kønsceller i gonaderne, bliver transduceret (5). Problemet kan i nogle tilfælde delvis løses ved at indføre vektoren ved direkte injektion eller vha. et kateter til det relevante sted i organismen, som det fx er gjort ved intrakardial injektion af en adenoviral vektor til fremme af angiogenesen (6). Store anstrengelser har imidlertid været gjort for at udvikle virale vektorer med snæver specificitet for det væv, der måtte være relevant i de konkrete tilfælde. Ofte drejer det sig om rekombinant modifikation af vektorens overflade, så den binder til en karakteristisk struktur på de relevante celler. Således har man fx indsat et enkeltkædeantistof mod overflade-receptoren cluster of differentiation (CD)34 i en AAV-vektor, så vektoren kunne binde til CD34-positive stamceller (7). Disse rekombinante metoder til at opnå specifik tilhæftning har imidlertid i praksis været skuffende, bl.a. fordi en viral vektors tilhæftning til cellen og indtrængen i den som regel beror på forskellige receptorer, der skal virke sammen. Dette problem synes en ny lovende metode, molekylær avling, imidlertid at kunne løse (8) (Fig. 1 ).

Genekspression

Uanset hvilken vektor der benyttes til overførsel, er målet naturligvis ekspression af et eller flere terapeutiske gener, evt. med en fysiologisk relevant regulering. Virus indeholder fra naturens hånd promotorer, som styrer ekspres- sionen og koordineringen af virusreplikationen. Fjernelse af de virale elementer i vektorerne - bl.a. for at gøre dem replikationsinkompetente - og indsættelse af nye regulerende promotor-elementer byder på yderligere udfordringer for at opnå det ønskede niveau af genekspression. De problemer, som findes, er bl.a. promotor-interferens, polycistroniske effekter, codonbrug, DNA-metylering, histonacetylering mv. Selv om vanskelighederne er betydelige, synes de fleste af disse problemer ikke at være principielt uløselige (Tabel 2 ).

Genekspression i nogle relativt få transducerede celler er imidlertid ikke altid nok. I visse tilfælde kan man opnå klinisk effekt ved at transducere selv få celler, som så producerer et relevant produkt, som fx faktorproduktion hos bløderpatienter, der har fået transduceret muskelceller med faktorgenet (9). Men ofte er der behov for en blivende genetisk korrektion af et helt vævskompartment som ved arvelige sygdomme eller alle tumorceller inklusive metastaser, som det er ønskeligt ved flere cancerformer. I disse situationer er der behov for en større udbredelse af den genetiske korrektion, end man kan opnå blot ved injektion af selv en relativt stor mængde vektor. Anvendelse af transducerede stamceller, der er oprenset fra patienten selv, høstet som embryonale stamceller eller fremstillet ved terapeutisk kloning, gør det muligt for en genetisk korrigeret celletype at repopulere patienten med funktionelt væv, som det fx er set ved SCID-X1 (10). Alternativt og særlig relevant ved metastaseret cancer er anvendelsen af replikationskompetente virale vektorer, hvor vektoren som ved en hvilken som helst anden virusinfektion naturligt spreder sig til det relevante væv. Selv om dette koncept naturligvis indebærer betydelige sikkerhedsmæssige problemer, har fx replikationskompetent adenovirus været anvendt til behandling af hoved- og halscancer (11), og også replikationskompetent herpes simplex-virus har været anvendt til behandling af glioblastom (12). I strikt forstand har der imidlertid indtil nu ikke været tale om genterapi, for så vidt som antitumoreffekten ikke er fremkommet ved overførsel af et terapeutisk gen, men ved udnyttelse af den onkolytiske effekt af visse rekombinante virus. I laboratorieforsøg arbejdes der imidlertid med udvikling af andre replikationskompetente vektorer, inklusive retrovirale vektorer, og disse vektorer vil givetvis også snart finde vej til kliniske forsøg (13).

Kliniske resultater

Arvelige sygdomme med en specifik (mono)genetisk defekt som årsag blev oprindelig betragtet som de mest oplagte sygdomme, hvor genterapi kunne give en terapeutisk effekt. Det første positive resultat med genterapi fremkom da også efter behandling af to børn med adenosindeaminasemangel (14). I det seneste og klart succesfulde forsøg behandlede man to børn med X-bunden immundefekt (10). Her blev hæmatopoietiske stamceller transduceret med en andengenerations retroviral vektor under optimerede dyrkningsbetingelser, og patienterne fik ikke anden behandling. I dette tilfælde så man, at patienterne gradvist blev repopuleret med normalt fungerende transgene celler, og der blev opnået klinisk normalisering.

Flere andre sjældne, arvelige sygdomme er i de senere år med større eller mindre held blevet behandlet med genterapi, fx chronic granulomatous disease (CGD) (15), Fanconis anæmi (16), cystisk fibrose (17) og Gauchers sygdom (18). Endnu er der tale om små forsøg, men i betragtning af de enkelte sygdommes sjældenhed, kan man ikke forvente samme omfang som for traditionelle kliniske forsøg. Dertil kommer, at der er mange, måske hundredvis, forskellige arvelige sygdomme, hvor genterapi potentielt er af terapeutisk værdi. Svarende hertil indtager prækliniske dyreforsøg en større rolle i vurderingen af den potentielle kliniske effekt. Ved blødersygdom med faktor IX-mangel viste dyreforsøg med mus og hunde, at der kunne opnås faktorekspression og klinisk bedring ved genterapi (19), og i overensstemmelse hermed viste det første kliniske forsøg med tre patienter en positiv effekt af AAV-overførsel in vivo af faktor IX til muskelvæv (9), og denne vektor er netop blevet godkendt som orphan drug i USA.

Dyreforsøg med effekt af genterapi af arvelige sygdomme indbefatter bl.a. Pompes sygdom, Duchennes muskeldystrofi, talassæmi, adrenoleukodystrofi og Hunters sygdom. Senest har forsøg med medfødt blindhed i en hundemodel for Lebers amaurose vist helbredende effekt af genterapi, og resultaterne fra igangværende kliniske forsøg afventes med spænding (20).

Genterapi over for andre sygdomsgrupper har ikke vist lige så overbevisende resultater, men der er gjort fremskridt inden for visse områder (Boks 1 ). I særlig grad har genterapi været forsøgt anvendt over for de kræftsygdomme, hvor man i dag ikke har tilstrækkelig effektive behandlingstilbud, og cancerforsøg udgør ca. 70% af de hidtidige genterapiprotokoller (21). Forsøgene baseres på flere forskellige strategier: øget immunreaktion over for tumorceller, pro-drug -aktivering, tumorsuppressorgener mv. (22). Trods adskillige positive resultater med påvisning af en vis, oftest lokal og forbigående anti-tumoreffekt må man dog konstatere, at der endnu ikke har været overbevisende behandlingsresultater, der entydigt peger på klinisk anvendelighed af genterapi ved cancer generelt. På længere sigt synes anvendelse af replikationskompetente vektorer in vivo dog at have et betydeligt potentiale ved visse cancersygdomme (11).

Bortset fra genterapi ved iskæmisk hjertesygdom, hvor der er vist klinisk signifikant effekt af adenoviral overførsel af angiogene faktorer (6, 23), er resultaterne fra genterapeutiske behandlingsforsøg ud over de ovenfor nævnte stadig langt fra klinisk anvendelighed. En række lovende dyreforsøg for en overvældende bred vifte af sygdomme (Parkinsons syge, diabetes, reumatoid artrit m.m.) giver dog grundlag for forventninger om, at genterapi på lidt længere sigt meget vel kan få en ganske omfattende betydning for medicinsk behandling.

Konklusion

Det mest iøjnefaldende ved klinisk genterapi er ikke, at det går specielt langsomt, for det gør det egentlig ikke. Når man tager i betragtning, hvor lang tid det erfaringsmæssigt tager, før en ny behandling udvikles for en enkelt velafgrænset sygdom, så falder udviklingen af genterapi ikke uden for det forventelige. Derimod er det iøjnefaldende, at det genterapeutiske koncept er forsøgt anvendt over for en bred og meget forskelligartet vifte af sygdomme, fra monogenetiske arvelige sygdomme over maligne cancersygdomme til aterosklerotiske hjerte-kar-sygdomme. Feltet er præget af parallelle og inkrementelle fremskridt, og en hovedårsag hertil er, at de vanskeligheder, der skal overvindes, i høj grad er beslægtede, uanset hvilken specifik sygdom der er tale om. Det er derfor ikke så meget sygdomsspecifikke problemer, der udgør flaskehalsen i den kliniske anvendelse, men derimod grundlæggende virologiske, molekylærbiologiske, cellebiologiske og immunologiske problemer. Genterapi kan således ikke betragtes som en slags underspeciale til fx klinisk genetik eller onkologi, men udgør derimod en selvstændig faglig disciplin, der benytter sig af ekspertise fra en række eksisterende specialer.

Sygdomme, der egner sig til genterapi med ex vivo-overførsel af det genterapeutiske materiale, hvor dette er af begrænset størrelse, og hvor fysiologisk regulering ikke er nødvendig, vil være de mest velegnede til genterapeutisk behandling. Derfor må man formode, at man vil have større chance for succes med genterapi ved monogene arvelige sygdomme end ved fx geno- og fænotypisk heterogene sygdomme som cancer. Den nuværende indsats til udvikling af endnu bedre vektorer og ikke mindst udvikling af forbedret stamcelleteknologi herunder terapeutisk kloning kan forventes at bringe terapeutiske tilbud inden for rækkevidde for en lang række hidtil uhelbredelige arvelige eller degenerative sygdomme.

Summary

Viral vectors for clinical gene therapy.

Ugeskr Læger 2002; 164: 4272-6.

The first positive clinical results of gene therapy trials have now become evident. The relatively few positive results and the numerous negative trials make it possible to identify both problems and potential for new development. The biggest problems have come from the viral vectors used for gene transfer. Most of the successful gene therapy trials have involved monogenetic diseases, where the relevant tissue has been isolated ex vivo, and where a retroviral vector has been inserted into the therapeutic gene in the nuclear DNA. Gene therapy seems to have a definite therapeutic potential in several rare, inherited diseases and also in certain acquired diseases, such as ischaemic heart disease.

Antaget den 27. marts 2002.

Center for Små Handicapgrupper, og

H:S Hvidovre Hospital, infektionsmedicinsk afdeling.