Fremtidens patologi: Ny metode viser proteiners aktivitet i vævet

Analyser af proteiner og deres placering i vævet er en nøgle til at forstå sygdomsmekanismer, udvikle nye terapier, diagnosticere sygdom og undersøge effekten af behandlinger. Derfor har forskningen i proteiner taget fart i de seneste år, og nye metoder og teknologier til at udforske proteinerne har set dagens lys.

Med de nyeste teknologier er det muligt at tage billeder af flere proteiner i en enkelt vævsprøve, men det er stadig vanskeligt at undersøge, hvordan proteinerne agerer indbyrdes, og hvordan de spiller sammen med aktiviteten i cellerne og med vævets struktur.

Det skal en ny metode, udviklet af et internationalt hold af forskere med dansk deltagelse, rette op på. Pathology-oriented multiplexing eller PathoPlex, som metoden hedder, kombinerer ekstremt detaljerede billeder af proteiner med et computerprogram, som finder mønstre i, hvordan proteinerne arbejder sammen i cellerne.

Metoden kan anvende mange forskellige antistoffer, som er de stoffer, der identificerer proteinerne, og patologen kan analysere flere vævsprøver på én gang og flere end 100 proteiner i én enkelt vævsprøve.

I første omgang er metoden, som kombinerer avanceret billedbehandling med maskinlæring, beregnet til forskningsbrug, men på længere sigt regner forskerne med, at den også bliver relevant i klinikken.

Metoden er frit tilgængelig og kræver ikke dyrt specialudstyr. Og forskerne håber, at den nye metode vil gøre det muligt at identificere sygdomsfremkaldende forandringer, og dermed bane vejen for personaliserede behandlinger.

PathoPlex er netop præsenteret i tidsskriftet Nature, og førsteforfatter på artiklen er postdoc Malte Kuehl fra Aarhus Universitet.

»I stedet for kun at se en lille del af billedet ad gangen giver PathoPlex mulighed for at se alle detaljerne samlet på tværs af skalaer og processer. Med høj opløsning og mulighed for at spore snesevis af forskellige mål på én gang kan vi endelig forstå, hvordan forskellige celletyper, subcellulær organisation og cellesignalering hænger sammen«, skriver Malte Benedikt Kuehl i en mail til Ugeskrift for Læger.

Sidsteforfatter er professor Victor Puelles fra Institut for Klinisk Medicin på Aarhus Universitet, som ledede og koordinerede forskningsprojektet. Deltagere var ud over de danske forskere også forskere fra Japan, Tyskland, Australien, Frankrig, Schweiz og USA.

Vigtigt at metoden er tilgængelig for mange

Med traditionelle metoder som immunhistokemi (IHC), identificerer man i hospitalernes patologiske laboratorier typisk et fåtal af specifikke proteiner i en vævsprøve som biomarkører især for kræft, hvilket er tilstrækkeligt til mange rutinediagnoser.

Nyere og mere avancerede mikroskopimetoder under fællesbetegnelsen multiplex proteinbilleddannelse har gjort det muligt at analysere mange flere proteiner i en vævsprøve.

Det kan være relevant for at diagnosticere undergrupper af sygdomme, planlægge skræddersyede behandlinger og vurdere behandlingseffekter.

Med nogle af de nyere metoder er det muligt at analysere omkring 40-60 proteiner eller flere, men metoderne er ikke standard på de fleste hospitaler. De er ekstremt dyre, kræver avanceret udstyr og kompleks dataanalyse, og er derfor primært forbeholdt forskningslaboratorier og højtspecialiserede klinikker. Og så har de ifølge Malte Kuehl også begrænsninger i forhold til detaljeringsgraden.

»Vi ville drive udviklingen endnu videre og flytte grænserne med fokus på subcellulære analyser, hvor man kan se detaljer inde i cellerne. Det gør vi med pixel-level clustering, hvor computeren automatisk grupperer pixels, der ligner hinanden, samtidig med at vi har skaleret til over 100 proteiner inden for de samme prøver. Og det sker ved pixelopløsninger på mellem 80 og 160 nm, som repræsenterer grænsen for, hvad man fysisk kan opnå med almindeligt optisk lys«.

En afgørende forskel på den nye metode og de eksisterende kommercielle er også i følge Malte Kuehl, at den er nem at tage i brug.

»PathoPlex kræver ikke andet specifikt udstyr end de fluorescensmikroskoper, som typisk findes i de fleste patologiafdelinger og forskningslaboratorier. For at reducere den manuelle arbejdstid har vi udviklet 3D-printbare beholdere og instruktioner til brug af billige 3D-printere som automatiserede væskehåndteringssystemer, og protokollen er i øvrigt kompatibel med en lang række billedkamre. Alle trin kan også udføres ved manuel pipettering«.

Test afslørede nye sygdomsprocesser

Forskerne har bl.a. testet metoden på vævsprøver af nyrer fra patienter med diabetes.

De tog detaljerede billeder af næsten 150 forskellige typer af proteiner i hver celle og med det tilhørende computerprogram analyserede de milliarder af datapunkter for at finde mønstre i proteinerne, som kunne afsløre aktiviteten i cellerne. Derved fandt de komplekse sygdomsprocesser, som ikke kan opdages med konventionelle metoder, forklarer Malte Kuehl.

»Vores eksperimenter afslørede både kendt og ny biologi. I nogle tilfælde inkluderede vi antistoffer på grund af deres rapporterede ekspression i visse nyrecelletyper. Vi fandt imidlertid ud af, at de spiller en rolle i andre celletyper også. Det overraskede os, hvordan vi på pixelniveau kunne fange celletype og molekylær information samtidig, og at vi fik så meget data ud af analysen«.

Forskerne fandt bl.a., at bestemte mønstre af proteiner kunne forudsige, hvordan nyrerne fungerede. Et overraskende fund var potentielt sygdomsfremkaldende stresssignaler i de rørformede strukturer i nyrer, som ellers så normale ud. Og i væv fra patienter, som fik diabetesmedicin i form af SGLT2-hæmmere, kunne forskerne se den beskyttende effekt af medicinen. Forskerne fandt også, at metoden kan anvendes på væv fra andre organer som f.eks. væv fra lever og hjerne.

Endnu er metoden ikke i brug på hospitaler, men det er et spørgsmål om tid, oplyser Malte Kuehl.

»Der er barrierer bl.a. i reproducerbarheden og certificeringskravene til klinisk brug, men vi arbejder aktivt med det. Og vi har flere igangværende forskningsprojekter, der bruger PathoPlex, og har til formål at generere den nødvendige indsigt på tværs af forskellige organer og sygdomme, så metoden kan bredes ud og tages i brug også på hospitaler«.