Antenatal bestemmelse af føtal RhD-blodtype baseret på føtalt DNA i plasma fra den RhD-negative mor - sekundærpublikation

Immunisering mod rhesus D-blodtypeantigenet er den hyppigste årsag til hæmolytisk sygdom hos fostre og nyfødte (HDFN). Vi har etableret en test til antenatal bestemmelse af føtal RhD-blodtype på grundlag af føtalt DNA i maternelt plasma. Vi anvendte realtids-polymerasekædereaktion ( real time PCR) baseret på påvisning af RHD- genets exon 7 og exon 10. Plasma fra 56 gravide RhD-negative kvinder i 15.-36. graviditetsuge blev analyseret. De genetiske resultater blev sammenlignet med RhD-blodtype bestemt serologisk efter fødslen. Forudsigelse af føtal RhD-blodtype baseret på tilstedeværelse af dele af RHD- genet var fra 16. gestationsuge 100% konkordant med serologisk blodtype.

Antistoffer hos moderen mod antigener fra rhesus (RH)-blodtypesystemet er den hyppigste årsag til hæmolytisk sygdom hos fostre og nyfødte (HDFN). RH-profylakse efter fødslen forhindrer immunisering mod RhD, men flere steder i udlandet anvendes profylakse tillige antenatalt for yderligere at reducere forekomsten af immunisering [1]. Kendskab til den føtale RhD-blodtype ville betyde, at man kunne nøjes med at give antenatal profylakse til kvinder, der bærer et RhD-positivt foster. Statistisk er det kun 60% af de RhD-negative-mødre, der bærer et RhD-positivt foster.

For de gravide kvinder, der på trods af profylakse alligevel er blevet immuniserede, vil tidligt kendskab til den føtale RhD-blodtype også være værdifuldt: Er fostret RhD-positivt iværksættes den nødvendige monitorering; er fostret derimod RhD-negativt kan man undgå unødige test og undgå at bekymre familien.

I forbindelse med antenatal profylakse skal fostrets RhD-blodtype kendes inden uge 28, mens fostrets RhD-blodtype hos immuniserede kvinder skal kendes så tidligt som muligt. I 1997 blev det vist, at frit føtalt DNA cirkulerer i moderens plasma under graviditeten [2] og i øvrigt forsvinder på mindre end en time efter fødslen [3]. Siden da er der med udgangspunkt i denne kilde til føtalt materiale blevet udviklet ikkeinvasive analyser til prædiktion af RhD-blodtype med detektionsstrategier gående fra påvisning af enkelte til multiple RHD- specifikke gensekvenser [1]. Påvisning af et RHD- gen hos et foster er dog ikke ensbetydende med, at fostret også får RhD-blodtypen, idet genet i sjældne tilfælde kan være til stede uden at give anledning til blodtypen.

Derfor er der tale om en forudsigelse og ikke en definitiv blodtypebestemmelse.

En sikker bestemmelse af et fosters RhD-blodtype har været vanskeliggjort af den sparsomme føtale DNA-mængde i maternelt plasma [4] - specielt i første trimester. Den føtale DNA-mængde stiger gradvist igennem graviditeten [4], så forudsigelsen er pålidelig i andet og tredje trimester.

Vores mål var at udvikle en sensitiv og præcis screentest for føtal RHD- genotype til brug ved antenatal profylakse. Vi designede et nyt primersæt, specifikt til realtids-polymerasekædereaktion (real time PCR) på ABI's 7500 Detection System, til påvisning af RHD- genets exon 7 i kombination med et publiceret primersæt til påvisning af exon 10 [5].

Materiale og metoder
Prøvemateriale

Blodprøverne blev indsamlet fra tre kohorter. Kohorte 1 var ikkegravide danske personer (n = 42). Kohorte 2 var RhD-negative gravide danske kvinder (n = 38) i 17.-36. graviditetsuge. Kohorte 3 var 18 gravide RhD-negative kvinder, hvorfra 21 anonymiserede plasmaprøver til validering blev leveret af The International Blood Group Reference Laboratory (IBGRL), Bristol, England. RHD- genotype og RhD-blodtype var ukendt af undersøgerne under analysen.

Prøvebehandling

Blodprøver fra kohorte 2 blev opsamlet i 7 ml-ethylen-diamin-tetra-acetat (EDTA)-rør og opbevaret ved stuetemperatur indtil plasma blev separeret ved centrifugering i ti minutter ved 1.700 × g, og to portioner a 1 ml plasma blev overført til Eppendorfrør, uden at celler blev taget med. Plasmaet blev umiddelbart frosset, og tiden fra prøvetagning til frysning var maksimalt 48 timer. Plasmaprøverne opbevaredes ved -20 °C indtil DNA-oprensning og realtids-PCR-analyse blev foretaget.

DNA-oprensning fra buffy coat

DNA blev oprenset fra buffy coat fra prøver fra kohorte 1 ved hjælp af QIAamp Blood Midi Kit (Qiagen Inc., Basel) efter protokollen for DNA Blood Midi Kit.

DNA-oprensning fra maternelt plasma

En volumen på 800 μ l plasma blev processeret med QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen Inc.) efter protokollen Blood and Fluid Spin Protocol med mindre modifikationer. Prøverne blev testet umiddelbart efter oprensningen. Ved hver oprensningsserie inkluderedes en positiv kontrol bestående af plasma fra et RhD-positivt individ blandet med plasma fra et RhD-negativt individ i forholdet 1:5 eller 1:8.

Realtids-PCR-analyse

DNA-prøver blev testet ved brug af realtids-PCR ABI 7500 Detection System (Applied BioSystems, Foster City) med TaqMan kemi. Sekvenserne for oligoer anvendt til opformering af RHD exon 7 var følgende: RHD ex7s: 5'-CAG CTC CAT CAT GGG CTA CAA-3'; RHD ex7a: 5'-CCG GCT CCG ACG GTA TC-3'; RHD ex7p: 5'-FAM-CAG CAC AAT GTA GAT GAT CTC TCC AAG CAG-TAMRA-3'. Primer RHD ex7a var identisk med D7b-antisense [6]. Oligoer anvendt til opformering af RHD exon 10 var identiske med RD-A, RD-B og RD-T [5].

Amplifikationsreaktionerne med totalvolumen på 25 μ l blev lavet med Universal Master mix (Applied BioSystems). Template- volumen var 5 μ l, og den endelige primer og probekoncentration var henholdsvis 900 nM og 100 nM. Hver prøve blev analyseret i fire replikater for hvert prim er/probesæt - i alt otte reaktioner pr. person. Hver analyseopsætning indeholdt følgende kontroller: DNA fra en RhD-positiv, DNA fra en RhD-negativ og destilleret, sterilt H2 O i stedet for template.

Den termiske PCR-profil var to minutter ved 50 °C og 10 minutter ved 95 °C, efterfulgt af 45 cykler a 95 °C i 15 sekunder og 60 °C i et minut.

Forudsigelse af RhD-positiv blodtype defineredes som mindst to positive af de fire replikater for hver exon. Forudsigelse af RhD-negativ blodtype defineredes som en eller ingen positive af fire replikater for hver exon. Udfald herimellem betragtedes som inkonklusive.

Data blev omregnet til DNA i picogram (pg) via en standard. DNA i pg blev omregnet til DNA-kopier ved at dividere med 7 pg/kopi.

Resultater
Specificitet og sensitivitet

DNA oprenset fra buffy coat fra 42 personer, der repræsenterende alle de hyppigste Rh-fænotyper, blev analyseret for at demonstrere, at vores oligoer var specifikke for RHD- detektion. Resultaterne, RhD-positiv (n = 22) og RhD- (n = 20), fra genotypebestemmelse var konkordante med serologisk RhD-negativ blodtype med undtagelse af en prøve. En serologisk RhD-negativ prøve med sandsynlig genotype dCe/dCe blev genotypebestemt til at være RHD- positiv. Specificitet var derfor 94,7%, mens sensitivitet var 100%.

Bestemmelse af føtal RhD-type i maternelt plasma

Prøver fra 17.-36. graviditetsuge fra danske RhD-negative gravide kvinder blev analyseret. Der var 100% konkordans mellem forudsigelse af føtal RhD-type og postnatalt serologisk bestemt RhD-type, med RhD-positive (n = 24) og RhD-negative (n = 14) (Tabel 1 ).

Med valideringsprøverne fra IBGRL fra 15.-36. graviditetsuge var der 100% konkordans mellem forudsigelse af føtal RhD-type og den genotype og fænotype, der blev oplyst fra IBGRL (Tabel 1). En prøve blev dog bedømt som værende inkonklusiv, og RhD-type blev ikke forudsagt, da prøven var positiv i to ud af fire replikater med exon 7, men negativ med exon 10. Barnets prøve var RhD-positiv.

Estimering af antallet af føtale RHD- gen-kopier pr. ml maternelt plasma

Antallet af føtale RHD- genkopier pr. ml-plasma blev estimeret i alle RHD- positive prøver (n = 34) fra kohorte 2 og kohorte 3 ud fra en standard oprenset fra buffy coat fra et RHD- hemizygot individ. Disse resultater viste en stigning i medianen af antallet af DNA-kopier med stigende gestationsalder (Tabel 2 ).

Diskussion

Vi præsenterer her en genomisk RhD-blodtypningstest, som fra 16. gestationsuge er 100% konkordant med serologisk blodtypning af barnet efter fødslen. Vi brugte dele af exon 7 og exon 10 som RHD- specifikke gensekvenser. I en nyligt publiceret artikel af Rouillac-Le Sciellour et al påviste man en konkordans på 99,5% (eksklusive inkonklusive prøver), ved brug af RHD- exon 7 og RHD- exon 10 som specifikke gensekvenser [7].

Antallet af føtale RHD- DNA-kopier pr. ml maternelt plasma og den gradvise stigning i antallet af kopier i forhold til gestationsuge svarer til tidligere observationer [8]. Variationen i individuelle DNA-niveauer, f.eks. i intervallet 34.-35. graviditetsuge (Tabel 2), er før beskrevet ved studier af føtalt DNA [4, 5]. Denne variation kan tilskrives enten individuelle faktorer eller variation i udbytte fra DNA-oprensningen.

To plasmaprøver fra 15. graviditetsuge repræsenterede den laveste gestationsalder i vores studie. Den ene prøve blev bedømt som værende inkonklusiv i forhold til vores definitioner. Vi havde desværre ikke mulighed for at teste moderen igen senere i graviditeten. Den anden prøve blev korrekt forudsagt at være RhD-negativ.

RH-blodtypesystemet rummer adskillige genetiske varianter, hvilket er en udfordring for RH-genotypebestemmelse. Visse sjældent forekommende typer vil kun blive opformeret i det ene af de to exoner i vores test. Hybridgener som RHD-CE(7-9)-D vil således blive defineret som inkonklusive. RHD ψ detekteres med vores setup; DNU og DII har hver deres eneste punktmutation liggende i sekvensen for primeren for exon 7 og forventes ikke at blive detekteret som RhD-positiv.

I de indledende test af specificitet og sensitivitet bedømte vi en RhD-negativ person til at være RhD-positiv. Denne person er homozygot med den meget sjældne haplotype dCe (r') med frekvensen 0,0098. Vi har tidligere i vores laboratorium bestemt et individ med samme haplotype til at være RHD- positiv. Et studie af den molekylære baggrund for falske positive resultater hos europæere viste en frekvens på 22% af RHD- positive blandt personer med dCe-haplotypen [9]. Vi har ikke klarlagt den molekylære baggrund for vores observation, men den er et eksempel på de genetiske varianter, der må forventes ved bestemmelse af RHD- genotype. Den kliniske konsekvens ville i dette tilfælde være, at der gives RH-profylakse uden grund, hvilket dog er ufarligt for den enkelte gravide og hendes foster. Den omvendte situation, at der fejlagtigt bestemmes et RhD-negativt foster, blev ikke set i vores materiale. En falsk negativ analyse ville betyde, at moderen ikke fik antenatal RH-profylakse, men efter fødslen ville den serologiske rhesustypning af navlesnorsprøven vise den korrekte blodtype, og RH-profylaksen ville blive givet. Profylaksen ville da blive lige så god som den i dag anvendte.

Det er væsentligt at gøre sig klart, hvilken klinisk opgave man søger at løse med RHD- genotypebestemmelse. Vores mål var at udvikle en sikker og præcis test til bestemmelse af RhD-type til anvendelse ved antenatal RH-profylakse i Danmark. Vores RHD- specifikke gensekvenser er valgt blandt de områder af RHD- genet, der afviger mest fra RHCE- genet, og som samtidig findes i alle de væsentligste RHD- varianter, der forventes at være i den danske befolkning.

Vores resultater viser, at vi kan imødekomme behovet for en RhD-bestemmelse før uge 28 i forbindelse med antenatal profylakse. Ved udredning af immuniserede kvinder giver vores analyse en sikker bestemmelse ned til 16. gestationsuge. Ved negative og inkonklusive resultater bør moderen testes igen efter en uge.

Yderligere undersøgelser vil vise analysens værdi til forudsigelse af RhD-blodtype før 16. gestationsuge.

Summary

Antenatal determination of fetal RhD-blood type based on fetal DNA in plasma from the RhD-negative mother

Ugeskr Læger 2006;168(26):2568-2570

We present a reliable test for prenatal prediction of fetal RhD type using maternal plasma from RhD- women. This test is needed for a future antenatal RH prophylaxis. A new real time PCR based assay targeting RHD exon 7 and a published assay for RHD exon 10 we re used to determine the fetal RHD status in DNA extracted from plasma from 56 pregnant women in 15th -36th week of gestation. Prediction of fetal RhD type was compared with the phenotype determined after birth, and showed 100% concordance. This setup will be of value in antenatal RH prophylaxis and in the management of immunised women.

Frederik Banch Clausen, H:S Blodbank, KI 2034, H:S Rigshospitalet, DK-2100 København Ø. E-mail: frederik.banch.clausen@rh.dk

Antaget: 27. marts 2006

Interessekonflikter: Ingen angivet

Taksigelse. Dette projekt blev støttet af Toyota-Fonden, Beckett-Fonden og Bloddonorernes Forskningsfond.

This article is based on a study first reported in the Prenatal Diagnosis 2005;25: 1040-4.