Erythropoietin - en ny terapi ved cerebral iskæmi?

Renalt dannet erythropoietin (EPO) er kendt som en vigtig hæmatopoietisk faktor, og den rekombinante humane form anvendes i dag med stor succes i behandlingen af anæmiske tilstande. EPO og dets receptor findes også i gliaceller, neuroner og cerebrovaskulært endotel, og ekspressionen i CNS opreguleres under iskæmi eller hypoksi. Ny forskning har vist, at intratekal administration af EPO har en markant antiinflammatorisk og neuroprotektiv virkning ved akut cerebralt insult hos gnavere. Virkningsmekanismerne omfatter en opregulering af specifikke apoptosehæmmende og antioxidative signalveje. Desuden kan neurotrofiske og angiogenetiske virkninger af EPO bidrage til en længerevarende protektion. Også systemisk administreret EPO reducerer neuronskaden efter cerebral iskæmi og forhindrer desuden tabet af autoregulationen af hjernens gennemblødning efter eksperimentel subaraknoidalblødning. Rekombinant humant EPO er et sikkert og atoksisk lægemiddel, og de nye opdagelser varsler et væld af potentielle terapeutiske muligheder.

EPO er et cytokinhormon, der hovedsageligt dannes i nyrerne og leveren, og som længe har været kendt for sin centrale rolle i erytropoiesen. Den rekombinante humane form af EPO (rHuEPO) blev introduceret som lægemiddel i 1989 og er siden blevet anvendt med stor succes til behandling af anæmi ved eksempelvis kronisk nyreinsufficiens eller cancer. Kliniske erfaringer har vist, at rHuEPO er et sikkert, atoksisk lægemiddel med få bivirkninger. Ny forskning har overraskende vist, at EPO, uafhængigt af den erytropoietiske virkning, har betydelige antiinflammatoriske og neuroprotektive virkninger, som måske vil kunne anvendes i behandlingen af akut cerebral skade.

EPO og dets receptor udtrykkes i CNS

EPO-mRNA er blevet påvist i hjernevæv hos både mus, rotter, aber og mennesker (1-4). Produktionen varetages her primært af astrocytter (3), men også neuroner producerer EPO (4-6). Cerebralt EPO er mindre end cirkulerende EPO (33 kDa vs. 35 kDa), på grund af en ringere grad af glykosylering (7).

Hos mus findes bindingssteder for EPO i blandt andet hippocampus og neocortex (2), to områder som er særligt vulnerable for hypoksi (8). Siden er der påvist EPO-receptorer (EPO-R) i tilsvarende områder af menneskehjernen (3). Ved hjælp af RT-PCR, in situ-hybridisering og immunhistokemi er der fundet EPO-R-mRNA og funktionelt protein i neuroner fra hippocampus og cortex (4, 5, 9, 10). EPO-R udtrykkes desuden af endotelceller, astrocytter og mikroglia/makrofager (4, 5, 11, 12). EPO-R tilhører cytokinreceptor type-1 superfamilien. Ved EPO's binding til EPO-R aktiveres den cytoplasmatisk tilknyttede tyrosinkinase Janus tyrosine kinase 2 (JAK-2). Herved fosforyleres transkriptionsfaktoren signal transducer and activator of transcription-5 (STAT-5), som kan regulere gentranskriptionen af signalvejens bioaktive produkter (13). Receptorer på erytrocytforstadier, karendotel og celler med neuronale egenskaber udviser forskelle i receptorantal og affinitet (9), men hvorvidt dette har betydning for EPO's cellespecifikke virkninger er endnu ikke afklaret, og der foreligger endnu ingen resultater vedrørende tætheden eller affiniteten af EPO-R på neuroner hos mennesker.

Forsøg med rotter har vist, at ekspressionen af EPO-mRNA i hjernen kunne induceres akut af hypoksi (1), og astrocytter fra rotter kan øge produktionen med en faktor 100 under hypoksi (7). I humane neuroncellekulturer medfører hypoksi en øget ekspression af EPO-R (14). Hos patienter med traumatisk hjerneskade (15) og hos neonatale patienter med asfyksi og intraventrikulærblødninger er der fundet forhøjede koncentrationer af EPO i cerebrospinalvæsken. Post mortem er der hos patienter med cerebralt infarkt eller hypoksisk hjerneskade fundet en markant opregulering af EPO og EPO-R i cerebrovaskulært endotel, neuronale celler og reaktive astrocytter (16). Hos gnavere opreguleredes mRNA- og proteinekspressionen af EPO-R i neuroner i penumbrazonen efter fokal cerebral iskæmi (5, 17). Den neuroprotektive betydning af denne bemærkelsesværdige mekanisme er blevet understreget af in vivo-forsøg, som viste, at neutralisering af hjernens endogene EPO med opløselige EPO-R forværrede neuronskaden i hippocampus efter et iskæmisk insult og nedsatte indlæringsevnen hos forsøgsdyrene (18). Ekspressionen af EPO reguleres af hypoxia inducible factor-1 (HIF-1), som også inducerer dannelse af bl.a. glykolytiske enzymer, der samlet set fremmer organismens adaptation til et hypoksisk eller oksidativt insult. Som fremført af Siren et al (19) hænger det teleologisk godt sammen: Øget renal produktion af EPO, og dermed øget iltbindingskapacitet, repræsenterer organismens adækvate respons på hypoksi, mens øget cerebral produktion af EPO beskytter neuronerne, de mest sårbare celler for hypoksi.

rHuEPO virker neuroprotektivt in vivo

Opdagelsen af et endogent, neuroprotektivt EPO/EPO-R-system har naturligt ledt til spørgsmålet om, hvorvidt en farmakologisk stimulation af systemet vil have en gunstig virkning ved cerebral iskæmi. Flere uafhængige publikationer viser, at rHuEPO har en markant neuroprotektiv virkning i forskellige dyreeksperimentelle modeller af akut cerebral skade (Tabel 1 ). I en model af global cerebral iskæmi hos ørkenrotter reducerede intratekal infusion af rHuEPO celleskaden i CA1-regionen i hippocampus (18) og formindskede tabet af indlæringsevne hos dyrene. Intratekal infusion af rHuEPO reducerede det kortikale infarktvolumen, orienteringsbesvær og sekundær talamisk degeneration efter fokal cerebral iskæmi (5, 17).

Det har overraskende vist sig, at rHuEPO ikke nødvendigvis skal administreres intratekalt for at virke neuroprotektivt. Efter kortvarig global iskæmi hos ørkenrotter sås sammenlignelige virkninger af intratekal og intraperitoneal administration på overlevelse, neurontab i hippocampus og graden af oxidativ skade i CNS (20). Intraperitoneal administration af rHuEPO op til seks timer efter et fokalt iskæmisk insult medførte en reduktion i infarktvolumen på mellem 50% og 75% (11), og i overensstemmelse hermed et næsten totalt fravær af apoptotiske neuroner i penumbrazonen (19). I dyreeksperimentelle studier af subaraknoidalblødning (SAH) medførte intraperitoneale injektioner af rHuEPO en forbedring i overlevelsesprocenten og den funktionelle restitution (22) samt en markant reduktion i antallet af nekrotiske neuroner i cortex (21). For nylig vistes, at en enkel subkutan behandling med rHuEPO, der blev givet umiddelbart efter eksperimentelt induceret SAH, hos rotter normaliserede autoregulationen af hjernens gennemblødning (23).

EPO's neuroprotektive v irkningsmekanismer

I knoglemarven stimulerer EPO erytrocytforstadiernes proliferation og differentiering, bl.a. ved hæmning af programmeret celledød, apoptose (19). EPO virker også antiapoptotisk i neuronale celler (4, 19), og meget tyder på, at dette også er tilfældet in vivo (19). Den intracellulære signaltransduktion med aktivering af JAK-2 og STAT-5, som er karakteristisk for virkningen af EPO i hæmatopoietisk væv, er også funktionel i neuroner (19). Signaltransduktionen omfatter en aktivering af mitogen activated protein kinase (MAPK) og fosfatidylinositol-3-fosfatkinase (19), en signalvej som også benyttes af andre endogene, neuroprotektive substanser, som f.eks. brain derived neurotrophic factor. Nye forsøg tyder på, at EPO's hæmning af NO-induceret apoptose i kortikale neuroner fra rotter omfatter en aktivering af transskriptionsfaktoren nuclear factor (NF)-κ B (25). Den EPO-medierede aktivering af NF-κ B er specifik for neuroner og sker muligvis via cross-talk fra JAK-2, som man hidtil har antaget kun aktiverede STAT-familien (25). En vedholdt opregulering af NF-κ B vides at øge transskriptionen af visse apoptosehæmmende proteiner, som blokerer aktiveringen af specifikke proteaser og opregulerer ekspressionen af antioxidative enzymer (26).

Neural celledød pga. apoptose eller nekrose er resultatet af en kompliceret proces, der omfatter en række intracellulære ændringer i blandt andet pH, ATP- og elektrolytkoncentrationen samt en øget produktion af de cytotoksiske, reaktive iltradikaler NO, superoxid og peroxynitrit (8). Aktiveringen af EPO-R-relaterede signalveje igangsætter tilsyneladende flere potentielt neuroprotektive og antiinflammatoriske mekanismer, som på forskellige niveauer kan hæmme det neuroinflammatoriske respons og efterfølgende apoptose (Fig. 1 ). Hypoksi/iskæmi fører i CNS til øget frigørelse af den eksitatoriske aminosyre glutamat, som via en øget dannelse af NO spiller en afgørende rolle for udviklingen af apoptose (8). Forbehandling med rHuEPO beskyttede hippokampale og kortikale neuroner mod glutamatinduceret celledød på en dosisafhængig måde (10) og medførte en markant reduktion i celledød forårsaget af NMDA (en glutamatreceptoragonist) i en blandet kultur af neuroner og astrocytter fra musens neocortex (5). EPO hæmmer desuden produktionen og aktiviteten af inducerbar NO-syntase og samtidig opreguleres ekspressionen af flere antioxidative enzymer (18, 20, 27-30).

Patologiske cerebrovaskulære ændringer i form af vasospasmer og forstyrret autoregulering af den cerebrale blodgennemstrømning bidrager efter SAH eller hovedtraume afgørende til udviklingen af sekundær cerebral iskæmi (31). Den cerebrovaskulære dysfunktion karakteriseres af et inflammatorisk respons med nedsat dannelse af endotelderiveret NO og øget ekspression af endoteliale adhæsionsmolekyler (8, 31). I dyreeksperimentelle modeller er systemisk administration af rHuEPO fundet at kunne reducere antallet af inflammatoriske celler efter et stumpt traume (11) og at kunne normalisere den cerebrale autoregulation efter SAH (23). I betragtning af EPO's antiinflammatoriske virkninger i vaskulært væv (24-30) er det muligt at en væsentlig del af EPO's neuroprotektive virkninger in vivo er sekundære til en gunstig virkning på endoteliale receptorer, uafhængigt af en evt. passage over blod-hjerne-barrieren.

EPO besidder desuden angiogenetiske og neurotrofiske egenskaber, som menes at medvirke ved ophelingen efter et hypoksisk/iskæmisk insult (12, 19, 32-34). En neurotrofisk sekvens, som er adskilt fra de hæmatopoietiske domæner, og som muligvis medierer de neurotrofiske virkninger af EPO, er for nylig blevet påvist (35).

Perspektiver

Den nye viden om EPO's antiinflammatoriske og neuroprotektive virkninger vil uden tvivl få stor betydning for den neurobiologiske forskning fremover. Opdagelsen er imidlertid særlig interessant, fordi vi råder over en indregistreret, rekombinant human form af EPO, som efter tretten års anvendelse i behandlingen af anæmi hos millioner af patienter har vist sig at være et atoksisk lægemiddel med yderst få bivirkninger. De i dyreforsøgene virksomme, neuroprotektive doser overstiger ikke væsentligt dem, som i dag anvendes til behandling af f.eks. patienter med knoglemarvskræft. De neuroprotektive og antiinflammatoriske virkninger af EPO indtræder timer til dage efter administration af enkeltdoser, mens den erytropoietiske virkning kun opnås efter ugers vedvarende behandling med EPO, og hos raske forsøgspersoner ses der ingen bivirkninger selv efter administration af meget høje enkeltdoser (36). Hos uræmiske patienter kan der efter måneders behandling med EPO optræde tromboemboliske komplikationer og arteriel hypertension, men dette betragtes dog som acceptabelt i forhold til den veldokumenterede terapeutiske gevinst (37). Ved en bolusbehandling vil risikoen for sådanne uønskede virkninger formentlig være reduceret væsentlig.

EPO-R opreguleres i penumbrazonen efter et iskæmisk insult (5, 17), og det er muligt, at behandling med rHuEPO kan forstærke et utilstrækkeligt endogent forsvar mod neuronal celledød. For at virke neuroprotektivt og antiinflammatorisk skal EPO tilsyneladende administreres inden insultet eller tidligt under udviklingen af et (neuro)inflammatorisk respons. Dyreforsøg tyder på et terapeutisk vindue på op til seks timer efter et hovedtraume eller et iskæmisk insult (11), og at virkningen af en bolus holder sig i mindst tre dage (19). Dette er foreneligt med, at EPO igangsætter en nydannelse af protektive proteiner. Det er foreslået, at en endogen, hypoksiinduceret opregulering af EPO-syntesen indgår i det velkendte fænomen hypoksisk prækonditionering, hvor en kortvarig, mild hypoksisk eksposition beskytter mod efterfølgende, sværere ekspositioner (25). Farmakologisk prækonditionering med rHuEPO kan således udgøre en attraktiv terapeutisk strategi i den profylaktiske behandling af sekundær cerebral iskæmi efter f.eks. hovedtraumer eller SAH. Andre muligheder for udnyttelse af EPO's virkninger kunne være præoperativ administration ved koronar bypasskirurgi eller andre operationer med øget risiko for postoperativ hjerneskade. De nye opdagelser varsler et væld af terapeutiske muligheder, og kliniske forsøg, som inden for de næste år vil vise, om EPO også er neuroprotektivt hos mennesker er undervejs.

Summary

Erythropoietin: a new job for an old friend.

Ugeskr Læger 2003;165:2477-81.

Erythropoietin (EPO) is a cytokine which is commonly associated with its central role in erythropoiesis. The clinical applications of the recombinant hormone are currently restricted to the treatment of anemia in renal failure and cancer. Recent studies, however, have suggested a new role for EPO as an anti-inflammatory and neuroprotective drug. EPO and its receptor are expressed in neurons, glial cells and brain capillary endothelial cells, and the system is upregulated in conditions of cerebral ischaemia and hypoxia. Animal studies have now established that intracerebroventricular administration of recombinant EPO exerts neuroprotection in models of stroke. The mechanisms appear to involve an upregulation of specific anti-apoptotic and anti-inflammatory pathwa ys. In addition, neurotrophic and angiogenetic effects of EPO may contribute in a long latency protection. Interestingly, also systemic administration of recombinant EPO ameliorates neuronal damage after brain ischaemia, and prevents the loss of autoregulation of cerebral blood flow following experimental subarachnoid haemorrhage. Recombinant human EPO is a safe and non-toxic drug, and clinical studies are currently investigating the neuroprotective potential of EPO in humans.

Niels Vidiendal Olsen, Neuroanæstesiologisk Klinik 2091, Neurocentret, H:S Rigshospitalet, DK-2100 København Ø.

Antaget den 20. marts 2003.

H:S Rigshospitalet, Neurocentret, Neuroanæstesiologisk Klinik.