Fosterceller i gravide kvinders blod som materiale til fosterdiagnostik

Fosterdiagnostik indgår som en naturlig del af svangreomsorgen. Diagnostik af kromosomsygdomme og monogene sygdomme baseres på fosterceller, der udtages enten ved fostervands- eller moderkageprøve. Disse undersøgelser er behæftede med en risiko på 0,3-1,5% for spontan abort. Derfor tilbydes de kun til gravide med kendt øget risiko for at få et barn med en medfødt sygdom. Det er et mål for genetisk forskning at basere fosterdiagnostikken på risikofri isolering af fosterceller fra den gravide kvindes blodbane [1].

Et holdepunkt for, at der findes fosterceller i den gravides blodbane, er, at det har været muligt at påvise kromosomsygdomme og monogene genetiske sygdomme hos fostre på grundlag af celler, isoleret fra den gravides blodbane. De to væsentligste årsager til, at der ikke allerede foreligger klinisk anvendelige metoder til at udnytte teknikken er: 1) Fosterceller forekommer med meget ringe hyppighed i den gravides blod; der er derfor behov for opkoncentrering eller andre metoder, der kan gøre opsøgning af fostercellerne mulig i praktisk klinik, 2) det har vist sig vanskeligt at udvikle velegnede (specifikke) markører til isolation og identifikation af fosterceller.

Hyppigheden af fosterceller hos gravide antages at være 2-6 celler pr. ml moderblod (1×10-6 -1×10-7 kerneholdige celler). Antagelsen baseres på undersøgelser af Hamada et al [2] og Krabchi et al [3]. Disse undersøgere har foretaget tælling af fosterceller på grundlag af forekomsten af Y-kromosom-signaler i interfaseceller i blodpræparater fra gravide kvinder med hanlige fostre. Undersøgelserne blev baserede på blodprøver, der ikke var udsat for berigelsesprocedurer, hvorfor resultatet kan anses for holdbart. Når Y-signalet anvendes som fostercellemarkør, er analysen uafhængig af celletype. Herved adskiller Hamadas og Krabchis undersøgelser sig fra de andre, hvor en specifik celletype har været mål for analysen, idet der ved disse blev anvendt forudgående berigelse af blodprøverne. Berigelse kan f.eks. være positiv selektion af celletypen ved hjælp af immunomagnetisk teknik (MACS) eller immunbaseret flowcytometriteknik (FACS); der kan også anvendes negativ selektion, hvor fjernelse af erytrocytter og leukocytter fra blodprøven foretages for at lette (muliggøre) tællearbejdet.

Forskellige fostercelletyper findes i den gravide kvindes blodbane. Man har påvist trofoblastceller og celler fra den hvide og den røde cellelinje [4, 5].

Interessen har i de senere år specielt været rettet mod føtale erytroblaster [6]. Disse er velegnede, fordi de kan identificeres ved mærkning med antistoffer mod embryonale hæmoglobinkæder. Endvidere er de hyppigt forekommende hos fosteret i den tidlige graviditet og kan derfor forventes at passere hyppigt over i den gravides blodbane. Erytroblasterne fra fosteret har endvidere en kort levetid i moderens blodbane. Det har vist sig muligt at isolere føtale erytroblaster fra gravide (Fig. 1 ).

Vi har på Rigshospitalet blandt andet udviklet en anvendelig protokol til at isolere og identificere føtale erytroblaster fra gravide kvinders blod [7]. Anvendelsen af denne protokol er baseret på »mild berigelse« af fosterceller i forhold til maternelle celler og opsøgning af fostercellerne ved hjælp af en mikroskopbaseret hurtig skanner. To modeller har været anvendt til udviklingen: 1) tilblanding af fosterceller til blod fra ikkegravide og 2) blodprøver fra gravide taget efter moderkageprøve. I sådanne blodprøver findes nemlig en forøget hyppighed af fosterceller, fordi fosterceller fra placenta går over i moderens blod i forbindelse med indgrebet. Ved undersøgelse af sådanne blodprøver finder vi fostererytroblaster i stort tal. Når denne teknik anvendes på blodprøver fra gravide kvinder, der ikke har fået taget moderkageprøve, har vi imidlertid fundet langt færre fostererytroblaster end forventet ifølge ovennævnte undersøgelser. Vi har derfor måttet konkludere, at der er et misforhold mellem antallet af fostererytroblaster i gravide kvinders blod (før moderkageprøve) og det almindeligt anslåede antal fosterceller, og at en klinisk anvendelig metode ikke alene kan baseres på fostererytroblaster.

Det konstaterede misforhold mellem undersøgelser af hyppighederne af fosterceller fundet ved anvendelse af Y-signalet uden forudgående berigelse og undersøgelser baseret på forudgående berigelse af blodprøverne for fosterceller indikerer, at andre celletyper end fostererytroblasten forekommer i den gravides blodbane og formentlig udgør den største del.

Man har tidligt interesseret sig for at isolere trofoblastceller fra den gravides blodbane [8]. Flere forskergrupper har arbejdet med identifikation af antistoffer til isolation og identifikation af trofoblaster [9]. Det har imidlertid vist sig vanskeligt at identificere velegnede antistoffer. En fransk gruppe har fokuseret på det forhold, at trofoblastcellen er større end andre celler i moderens blod [10]. Disse undersøgere har udviklet et specielt finmasket filter, som har muliggjort frasortering af trofoblastcellerne for videre testning. Det forventes at blive testet i forbindelse med et samarbejde i EU-regi. Vi gennemprøver nu et antistof mod HLA-G-antigenet [11].

Lymfocytter har ligeledes været mål for den noninvasive prænatale diagnostik. Lymfocytter og lymfocytforstadier kan selekteres ved hjælp af specifikke antistoffer f.eks. CD45. Interessen for lymfocytter er imidlertid aftaget efter at Bianchi et al [12] påviste, at lymfocytten og dens forstadier kan findes i den gravide kvindes organisme i mange år. Dette medfører en teoretisk risiko for, at fosterdiagnostik kan blive baseret på celler fra en tidligere graviditet.

Fokus på forskning i udnyttelsen af fosterceller i den gravide kvindes blodbane til fosterdiagnostik flyttes for øjeblikket fra erytroblaster til andre celletyper f.eks. trofoblaster, hvor forbedrede antistoffer er tilgængelige.

Et særligt aspekt vil være at undersøge fordelingen af forskellige fostercelletyper i moderens blod. I sammenhæng hermed skal der fokuseres på videreudvikling af berigelsesmetoder rettet mod celletyper, der udgør en større del af fostercellerne i den gravide kvindes blod end erytroblasterne. Beri-gelsesproceduren er vigtig, fordi berigelse medfører tab af fosterceller (egne upublicerede fund). Tabet kan skyldes, at der sorteres for andre celletyper end dem, der forekommer i størst mængde.

Vi har som nævnt på Rigshospitalet valgt en strategi, der baseres på meget begrænset berigelse; til gengæld gennemsøger vi store blodmængder ved hjælp af gennemskanning med en hurtig mikros kopbaseret skanner (MetaSystems). Skanneren finder automatisk de celler, der er specifikt mærkede med de fluorescensmærkede fosterspecifikke markører, disse kan f.eks. være hæmoglobinantistoffer eller trofoblastantistoffer. Efterfølgende kan mærkede celler automatisk genopsøges, betragtes på en skærm eller direkte i mikroskop. Kromosomdiagnostik vil kunne foretages ved in situ-hybridisering direkte på fosterceller på objektglasset, eller de vil kunne fjernes ved mikromanipulation og efter ekstraktion og opformering ved polymerasekædereaktion (PCR) analyseres genetisk [13]. (Skanneren er stillet til rådighed af MetaSystems, der også har modificeret den efter opgavens skiftende behov).

Der er betydelige muligheder for videreudvikling af skanneren. Af andre udviklingsperspektiver skal nævnes fosterspecifikke markører: Markørerne er indlysende vigtige for såvel sortering som opsøgning/identifikation. Nye markører kan forventes fundet ved proteinanalyse og genekspressionsanalyse af fosterceller fra blod- eller vævsprøver fra aborter samt fostervands- og moderkageprøver. Der sker i øjeblikket store fremskridt inden for billedanalyse til cellegenkendelse og nanoteknologi til cellesortering i forbindelse med anvendelse af fosterceller fra maternelt blod til prænatal diagnostik.

En anderledes indgang til noninvasiv prænatal diagnostik er udnyttelsen af forekomsten af føtalt DNA i den gravide kvindes blod. En gennemgang af problemstillingerne heromkring falder uden for denne statusartikel. Det bør dog nævnes, at det i dag er muligt at bestemme fosterets rhesustype ved undersøgelse af føtalt DNA fra en blodprøve fra moderen. Dette udnyttes allerede klinisk i England. Teknikken tillader at bestemme rhesustypen hos alle fostre af rhesusnegative kvinder. Dette gør det muligt at sikre mod hæmolytisk sygdom hos rhesuspositive fostre/børn allerede i graviditeten. Det vil også være muligt at diagnosticere dominant arvelige og nogle recessivt arvelige sygdomme ved analyse af føtalt DNA i maternelt plasma.

Forskningsaktiviteten på området er høj, til trods for at de betydelige anstrengelser, der er gjort indtil nu, ikke har ført til en klinisk anvendelig metode. Dette fremgik blandt andet af indlæggene ved en lukket konference i Washington i begyndelsen af 2003, hvor National Institutes of Health ønskede en status på området med henblik på den fremtidige administration af støtten til området. Det fremgår også af, at der inden for EU's sjette rammeprogram er etableret en europæisk forskergruppe med knap 50 deltagende grupper.

At det har vist sig muligt risikofrit at stille såvel kromosomdiagnoser som diagnoser på monogenetiske sygdomme på fosterceller fra gravide kvinders blod vejer tungt for at området videreudvikles, når man sammenligner med risikoen ved fostervands- og moderkageprøve.

Korrespondance: John Philip , Forskningsenheden for Prænatal Diagnostik,
JMC-4074, H:S Rigshospitalet, DK-2100 København Ø. E-mail: philipj@rh.dk

Antaget den 9. oktober 2003.

H:S Rigshospitalet, Juliane Marie Centret, Forskningsenheden for Prænatal
Diagnostik.

Vi takker følgende for værdifuld hjælp: Dhanesh Gohel , Immunicon, Andreas Plesch og Thomas Lörch, MetaSystems, Henning Djursing og afdelingssygeplejerske Grete Lovies, H:S Frederiksberg Hospital, Gynækologisk Afdeling og sekretær Anne-Grete Sidenius.