Fremmedlegemeinfektioner - nyt om biofilm og quorum sensing

Fremmedlegemeinfektioner er karakteriseret ved, at bakterier eller svampe vokser på fremmedlegemets indre og/eller ydre overflader som et lag, der holdes sammen af en biopolymermatrix, som mikroorganismerne selv har produceret. Denne vækstform kaldes sessil (fastgjort) eller en biofilm. Definitionen af en biofilm er således »et struktureret konsortium af celler (bakterier og/eller svampe) omgivet af en selvproduceret polymermatrix«. Matrix kan indeholde både polysakkarid, protein og DNA, og det mikrobielle konsortium kan indeholde en eller flere arter, som kan leve i symbiose med hinanden [1]. Matrix tilfører biofilmen strukturel stabilitet og yder beskyttelse mod en række ydre faktorer. Udviklingen af bakterielle biofilm over tid er studeret i konfokale skanninglasermikroskoper med anvendelse af green fluorescent protein -mærkede bakterieceller. Denne teknik kan kombineret med avanceret in silico-billedbehandling frembringe rumlige (tredimensionale) billeder af biofilm. For Pseudomonas aeruginosa -bakteriernes vedkommende udvikler en moden biofilm sig i løbet af knap en uge (Figur 1 ). Biofilmopbygningen indledes med, at individuelle (planktoniske), fritsvømmende mikrober bindes reversibelt til en overflade, som kan være konditioneret af protein o.a. i en pellikel. På det tidspunkt er bakterierne stadig følsomme for antibiotika, hvilket kan være forklaringen på antibiotikaprofylaksens effektivitet ved alloplastikoperationer. Dernæst følger irreversibel binding til overfladen, hvorefter bakterierne deler sig og danner mikrokolonier på overfladen og begynder at omgive sig med den selvproducerede matrix. Biofilmen bliver herefter tyk (op til 50 mikrometer) og man kan iagttage dannelsen af svampelignende eller tårnlignende strukturer. Biofilmen er nu moden. Senere følger så en fase, hvor lokale områder af biofilmen opløses, og de frigjorte celler kan derefter spredes til andre lokaliteter, hvor opbygning af nye biofilm så kan finde sted. I nogle tilfælde kan denne proces være forårsaget af bakteriofagvirksomhed [3]. Den modne biofilm kan ligefrem indeholde væskefyldte kanaler og dermed minde om primitive, flercellede organismer. Bevægelige bakterier kan ved hjælp af pili klatre op på toppen af biofilmen og kolonisere og dække bakterierne nedenunder [4].

I bakterielle biofilm har bakterierne andre egenskaber end planktoniske bakterier har, og det har nogle diagnostiske og terapeutiske konsekvenser, som skal beskrives i det følgende:

1. Bakterierne ser anderledes ud i biofilminfektioner end i planktoniske infektioner, idet de er lejret nær ved hinanden og omgivet af den selvproducerede matrix. Den kan ofte i kliniske præparater iagttages i mikroskopet, selv om identifikationen af bakterierne i biofilmen kræver DNA-hybridiseringsteknik, og identifikation af matrix' bestanddele kræver specialfarvning. Nogle forskere mener at kunne påvise biofilmspecifikke antistoffer under infektion, hvilket kan få stor betydning for diagnostik [5]. Det er nemlig ikke altid muligt med almindelig podeteknik at frigøre bakterierne, dyrkningsresultatet kan derfor være negativt, medmindre man forbehandler med ultralyd [6, 7].

2. Dybdegående studier af global genekspression i P. aeruginosa -biofilm tyder på adaptationer, både hvad angår fysiologi og biokemi, sammenlignet med planktoniske bakterier. Når mønsteret af genekspression i biofilmvækst undersøges, ses det, at cellerne udviser flest ligheder med planktoniske bakterier i stationær fase (hvilefase med lav metabolisk aktivitet). Ydermere ses udtryk af gener, der er kritiske for vækst under anaerobe forhold [8]. Ved mikroelektrodemålinger har man påvist, at i bunden af biofilmen er der primært anaerobe forhold, og bakterievæksten og metabolismen er meget langsom i modsætning til på biofilmens overflade, hvor der er aerobe forhold, og hvor celleaktiviteten foregår [9]. Sådanne fysiologiske forhold kan forklare noget af biofilmens resistens mod antibiotikabehandling, som beskrives nedenfor.

3. Bakterierne udviser en øget resistens over for antibiotika og desinfektionsmidler og over for de innate og adaptive forsvarsmekanismer [10, 11]. De molekylære mekanismer bag dette er en blanding af konventionelle resistensmekanismer, som også beskytter planktoniske bakterier mod antibiotika og de ovenfor nævnte egenskaber ved biofilmvækst, som øger bakteriernes resistens over for antibiotika. De konventionelle mekanismer er bedst studeret mht. beta-laktamase-baseret resistens og colistinresistens hos P. aeruginosa , hvor der sker en induktion af resistensmekanismerne under udsættelse for det pågældende antibiotikum, således at biofilmen producerer øget mængde betalaktamase, der nedbryder betalaktam-antibiotika [12] hen- holdsvis begynder at producere et ændret lipopolysakkarid, som gør bakterierne resistente over for colistin [13]. Når hertil kommer stationær fase-fysiologien af bakterierne i bunden af biofilmen [14, 15] og mulige diffusionsbarrierer og binding til biofilmens bestanddele, er tolerans- og recidivforholdene ved biofilminfektioner (Figur 2 ) i hvert fald til dels forklaret.

4. Bakterierne forårsager derfor kroniske infektioner med persisterende inflammation og vævsskade dvs. sygdom til følge. Kroniske infektioner er således infektioner, som persisterer trods terapi og trods værtens immun- og inflammationsrespons, og som til forskel fra kolonisering karakteriseres af persisterende patologi og immunrespons. Hermed er der også givet en karakteristik af fremmedlegemeinfektioner.

På baggrund af biofilmens og dermed fremmedlegemeinfektionernes egenskaber og resistens, der forårsager de kroniske infektioner, har der i mange år været behov for nye og forbedrede behandlingsprincipper. Sådanne gennembrud synes nu at være på vej, ikke mindst baseret på dansk forskning i metoder til at hæmme bakteriernes indbyrdes kommunikation, kaldet quorum sensing (QS).

Quorum sensing

Både evnen til at dan ne biofilm og evnen til at kommunikere med specielle signalmolekyler findes formentlig blandt størstedelen af bakteriearterne. Bakterier kommunikerer som anført ved at syntetisere og reagere på signalmolekyler. Betegnelsen QS hentyder til, at systemet tillader bakterierne at mærke, hvornår et kritisk antal bakterier er fremvokset på et begrænset område i værtsorganismen og som reaktion herpå at aktivere bestemte gener, så de producerer f.eks. virulensfaktorer o.l. I mange grampositive bakterier er QS-signalmolekylerne peptider, mens de mest kendte i gramnegative bakterier er N-acyl-L-homoserin-laktoner (AHL). Det klassiske eksempel er aktivering af bioluminescens (lysproduktion) i Vibrio fischeri, og de fleste AHL-producerende bakterier er knyttet til højere organismer som planter og dyr, hvor de er symbionter eller patogener [2]; det gælder f.eks. de menneskepatogene bakterier P. aeruginosa, Yersinia enterocolitica og Brucella melitensis . AHL syntetiseres af syntaseproteiner og samarbejder med transkriptionelle regulatorproteiner for at regulere ekspressionen af specifikt modtagelige gener, der f.eks. hos P. aeruginosa kontrollerer produktionen af virulensfaktorer, bl.a. ekstracellulære enzymer og cellelysiner (f.eks. rhamnolipid), der har betydning for sygdomsprocessen [16]. Bakterierne bliver således først virulente patogener, når de når et antal, hvor QS-systemet aktiverer virulensfaktorerne. Indtil da er de mere uskadelige kolonisatorer. QS kan muligvis også have betydning for biofilmens udvikling [17], og QS har vist sig at have afgørende betydning for biofilmens tolerans over for antibiotikabehandling og det innate inflammationsrespons eksemplificeret ved de polymorfnukleære leukocytter (PMN) [11, 18].

Quorum sensing-inhibitorer

Meget af den viden, vi har om QS, kommer fra forsøg med QS-knockoutmutanter og fra anvendelse af naturligt forekommende og syntetiserede QS-inhibitor (QSI)-stoffer [2]. F.eks. observeredes det, at visse tangplanter aldrig blev bevokset med først bakterier og derefter højere organismer (biofouling , der kendes fra skibssider under vandlinjen), og at det skyldtes, at tangplanterne producerer halogenerede furanoner, som viste sig at have QSI-aktivitet [19]. Screeningen for QSI-aktivitet blandt naturligt forekommende produkter var derfor oplagt og blev meget lettere efter introduktion af et dansk designet screeningssystem, der bygger på, at en genmanipuleret bakterie kun kan vokse, hvis der er QSI til stede i substratet [20]. Sådanne naturlige QSI-stoffer kan syntetiseres og modificeres strukturmæssigt, og det har vist sig, at man herved kan hæmme QS in vivo hos inficerede forsøgsdyr [21]. Da det blev påvist, at inficerende bakterier kommunikerer med hinanden in vivo [22], og at dette sandsynligvis også gælder hos f.eks. cystisk fibrose (CF)-patienter med kronisk P. aeruginosa -lungeinfektion, vil det være nærliggende at søge at behandle infektionen med farmaka, der udviser QSI-egenskaber [23]. Da det ydermere har vist sig, at makrolider, f.eks. azithromycin, besidder QSI-egenskaber, så de hæmmer P. aeruginosas virulens, selv om de ikke havde væksthæmmende egenskaber i de opnåelige koncentrationer (in vitro-resistens ved konventionel resistensbestemmelse), gennemførtes der nogle klinisk kontrollerede undersøgelser, hvori der blev påvist en gunstig klinisk effekt på patienternes lungefunktion under langtidsbehandling med azithromycin [24, 25]. De fleste CF-patienter med kronisk P. aruginosa -lungeinfektion bliver derfor kontinuerligt behandlet med azithromycin [26], hvilket imidlertid giver anledning til konventionel resistensudvikling hos andre bakterier hos patienterne [27]. Det er derfor ønskeligt at opdage eller udvikle QSI-lægemidler uden konventionel antibiotisk effekt, og det arbejdes der også intensivt på [28]. Et eksempel på sådanne naturligt forekommende QSI findes i hvidløgsekstrakt, som in vitro og in vivo har vist sig at gøre ellers resistente P. aeruginosa- biofilm modtagelige over for antibiotikabehandling og over for PMN's aktivitet, så biofilmen bedre kan bekæmpes af konventionel antibiotikabehandling og af legemets innate inflammationsrespons, som domineres af PMN (Figur 3 ) [11, 18]. Med den viden, vi har i dag, kan QSI-resistens kun opstå ved mutationer, som gør bakterierne ude af stand til at producere virulensfaktorer, dvs. at de bliver avirulente, ligesom hvis de blev behandlet med QSI-farmaka. Vi forudser, at såfremt det holder stik, vil resistensproblemer, som vi kender over for konventionelle antibiotika, ikke blive et klinisk problem.

Quorum sensing-inhibitorer-lægemidler som forebyggelse og behandling af fremmedlegemeinfektioner

Fremmedlegemeinfektioner udgør et stedse voksende problem i moderne medicin og strækker sig fra intravenøse katetre, urinvejskatetre, og trakealtuber til stenter (Figur 2), alloplastikmateriale, hydrocefalusventrikeldræn og kunstige hjerter [29]. Bliver et sådant fremmedlegeme koloniseret med en biofilm, kommer der kronisk inflammation omkring fremmedlegemet, som enten må fjernes eller behandles med sommetider livslang antibiotisk suppressionsterapi. Man har derfor introduceret antibiotikadækkede fremmedlegemer (katetre, karproteser o.l.) for at forebygge biofilmdannelsen, og det har også vist sig at have gunstig effekt [30, 31]. På grund af risikoen for resistensudvikling og allergi over for de pågældende antibiotika er det dog ønskeligt, at der udvikles andre stoffer, og her kommer QSI-farmaka stærkt ind i billedet. Det har da også vist sig in vitro, at QSI synergistisk kan forstærke antibiotikas og PMN's manglende effekt på biofilm, så den kan bekæmpes effektivt (Figur 3) [10, 16]. Disse interessante og lovende resultater danner basis for danske forsøg på videreudvikling af QSI til lægemidler til mennesker, der f.eks. får fremmedlegemer implanteret. Hvis det lykkes, vil det have meget store positive konsekvenser for moderne invasiv medicinsk behandling.

Niels Høiby, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling 9301, Rigshospitalet, DK-2100 København Ø. E-mail: hoiby@dadlnet.dk

Antaget: 23. oktober 2007

Interessekonflikter: Ingen angivet.

Artiklen bygger på et større antal referencer. En fuldstændig litteraturliste kan findes i artiklen på www.ugeskriftet.dk