Genterapi og cancer

I dag helbredes lidt under halvdelen af alle cancerpatienter, langt størstedelen helbredes ved kirurgi og strålebehandling, disse patienter har på diagnosetidspunktet lokal sygdom. De øvrige ca. 60% har systemisk sygdom på diagnosetidspunktet, og behandlingen til denne patienttype er medicinsk, i form af kemo- eller hormonterapi. Disse behandlingsformer kan øge patienternes overlevelse og give bedre livskvalitet, men kun 5-8% af patienterne bliver helbredt. Der er derfor et stort behov for udvikling af nye lægemidler.

Gennem de senere års basal-biologiske cancerforskning er der opnået en tiltagende dybere, men endnu ufuldstændig, forståelse af cancers opståen og udvikling. På det genetiske område er der kortlagt væsentlige ændringer, der er af betydning for udvikling og vedligeholdelse af cancersygdommen. Det vil sige, at i mange tilfælde kendes genotypen for den normale, den præmaligne og den maligne celle. Cancerudvikling er dog meget kompleks, idet der til stadighed opstår genmutationer i eksisterende tumorer, og udviklingen er ikke ens, hverken hos patienter med samme sygdom eller i den enkelte patients tumor. Resultatet er derfor en meget heterogen patientpopulation. Med de nyeste molekylærbiologiske teknikker til undersøgelse af gener og genprodukter er der nu mulighed for at afsløre ligheder mellem tumorer i stedet for blot forskelle. Dette fremskridt danner grundlaget for, at genterapi til cancerpatienter nu kan komme til at udgøre en potentiel behandlingsform.

Ved genterapi forstås en behandling, der består i, at der overføres DNA/RNA (en vektor) til alle eller nogle af patientens celler. Denne vektor indeholder et terapeutisk gen, der, efter at det er blevet aflæst i cellen, vil give anledning til et produkt (et protein), der forårsager et respons fx celledød (Fig. 1).

Da det ikke nødvendigvis er nogen fordel, at alle patientens celler rammes ved genterapi, kan man forsøge kun at ramme (targetere) tumorceller, og ikke normale celler. Dette kan gøres ved at koble en ligand eller et antistof til genterapivektoren, der primært binder sig til tumorcellen. En anden mulighed kan være at indbygge en mekanisme, der sikrer, at det terapeutiske gen kun bliver aflæst i tumorceller.

I de senere år er der brugt megen energi på at udvikle klinisk anvendelige genterapiregimina. Succeskriteriet for disse behandlinger er andre end blot de traditionelle: tumorrespons, overlevelse og livskvalitet. Her må der ydermere defineres surrogat-effektmål, der tilvejebringer evidens for, at den biologiske proces, som formodes at føre til respons, virkelig finder sted i patienten.

Til trods for 20 års intensivt udviklingsarbejde og med mere end 500 kliniske protokoller (http://www.wiley.co.uk/ wileychi/genmed/clinical/, juni 2001) er der endnu ikke designet en effektiv behandlingsstrategi for genterapi. Årsagen er blandt andet, at væsentlige basale problemer vedrørende målrettet targeting af tumorceller endnu ikke er løst. Disse problemer er:

1. Genterapien skal kunne administreres systemisk

2. Tumorcellerne skal kunne rammes effektivt

3. Det terapeutiske gen skal aflæses effektivt og danne grundlag for et funktionelt genprodukt

4. Behandlingen skal kunne styres og være sikker

I det følgende vil vi gennemgå de væsentligste problemstillinger vedrørende genterapi til cancerpatienter.

Administrationsform

Hidtil har mange af de kliniske protokoller benyttet sig af lokal injektion af genmateriale i tumor (1, 2). Fordelen ved denne metode, i eksperimentelt øjemed, ligger i muligheden for at inducere lokal tumorkontrol og teste surrogat-effektmål, såsom aflæsning og virkning af det injicerede genprodukt. Et væsentligt problem er dog fordelingen af genmaterialet, idet ikke alle celler bliver ramt ved injektionen, og genmaterialet ikke spredes ved intercellulær diffusion, men har en tendens til at lokalisere sig omkring »nålesporet«. Ydermere vil der ved tilbagetrækning af nålen afsættes genmateriale i det raske væv, hvilket især er et problem ved anvendelse af genmateriale, hvis produkt er toksisk (2). Til patienter med systemisk sygdom kan denne form for administration af gode grunde ikke anvendes. Det er derfor nødvendigt at udvikle en systemisk behandling, hvor genmaterialet kan pakkes i et kompleks, som er beskyttet imod nedbrydning i blodbanen, således at det når intakt og funktionelt frem til target-cellerne. Derudover skal komplekset formuleres således, at den uspecifikke binding til erytrocytter og diverse overfladeproteiner på ikke-tumorceller mindskes mest muligt (2).

Vektorer

I udviklingen af genterapi mod cancer er det vigtigt at finde en vektor, dvs. et transportsystem af det terapeutiske gen, der både er effektiv og sikker. Mange forskellige vektorsystemer af både viral og non-viral oprindelse er blevet testet (se Tabel 1). De hyppigst anvendte vektorer er dog virale (>72%) (http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical/, juni 2001), hvilket skyldes, at det er virus' natur, med høj effektivitet, at inficere en bred vifte af celler.

Virale vektorer

For at producere en vektor baseret på et viralt system, er det nødvendigt at fjerne dele af virus' genom for at få plads til at indsætte fremmed DNA/RNA (sekvensen for det terapeutiske gen m.m.). Når en del af virus' genom er fjernet, og det fremmede DNA/RNA er indsat, kaldes vektoren for en rekombinant viral vektor. Blandt de oftest anvendte vira findes retrovirus, adenovirus og adeno-associeret virus (AAV), der hver især har fordele og ulemper.

Retrovirus er den virusfamilie, der først blev anvendt til genterapi (10, 11). En fælles egenskab for retrovirus er deres evne til at blive integreret i værtens genom, hvilket sikrer en vedvarende produktion af et terapeutisk genprodukt. Visse retrovirus fx Oncovirinae kan ikke passere kernemembranen, og kan derfor kun inficere de celler, hvor kernemembranen er nedbrudt i forbindelse med celledeling (5). Dette er en stor ulempe, idet tumorer oftest består af få delende celler og flest ikke-delende celler (12). Andre retrovirus, såsom Lentivirinae, kan passere kernemembranen og kan derfor også inficere celler, der ikke deler sig. Dog er omfattende sikkerhedsaspekter vigtige ved brug af denne type virus, idet sidstnævnte familie bl.a. omfatter hiv (5).

En anden type virus, adenovirus, har længe været en lovende vektorkandidat. Den kan både inficere delende og ikke-delende celler, men infektionen er kun midlertidig, hvorfor produktionen af det terapeutiske genprodukt hurtigt ophører (11). Denne egenskab er i sig selv ikke nogen ulempe, hvis virus anvendes til behandling af manifest cancer, hvor en midlertidig produktion af et genprodukt, som medfører celledød, er fuldt ud tilstrækkelig.

Adenovirus har dog vist sig at være stærkt immunogent og toksisk, hvilket i 1999 førte til et stop for klinisk afprøvning med adenoviralt baserede vektorer i USA (http://www.fda.gov/, juni 2001). Der er tale om to typer af immunrespons imod adenovirus, et umiddelbart respons imod den virale kappe og et senere respons imod de virale proteiner, der produceres af de inficerede celler. Det umiddelbare respons er forsøgt undgået ved at give immunsupprimerende behandling sammen med administrationen af vektoren. Det sene immunrespons er forsøgt undgået ved at fjerne mest muligt af adenovirusgenomet, således at den rekombinante vektor kun indeholder de helt essentielle virale genomsekvenser. Ved på denne måde at undgå det sene immunrespons ses signifikant mindre cellulær infiltration og inflammation, og samtidig opnås der en væsentlig længerevarende produktion af det terapeutiske genprodukt (13).

Den sidste af de hyppigt anvendte virus er adeno-associeret virus (AAV). AVV kan inficere både delende og ikke-delende celler, og der ses ikke noget immunrespons i forbindelse med en infektion. AAV integreres i genomet på en specifik position på kromosom 19. Dette giver den fordel, at risikoen for at virus integreres på et sted, hvor det kan forvolde skade (fx ødelægge et tumorsuppressorgen), minimeres. Denne specificitet mistes dog ofte, når dele af AAV-genomet fjernes for at producere en rekombinant AAV. Derudover er kloningskapaciteten meget begrænset i AAV (se senere), hvilket nedsætter anvendeligheden drastisk (6).

En væsentlig ulempe ved de viralt baserede vektorsystemer er, at deres optag i cellerne er uspecifikt og ofte ineffektivt. Det sidst nævnte skyldes bl.a., at de receptorer, som virus binder til (fx de primære receptorer for adenovirus og Coxsackievirus), ofte er mangelfuldt repræsenterede eller defekte i tumorceller (14). Man har derfor forsøgt at modificere de virale vektorer for at øge optagelsen og specificiteten, bl.a. ved at ændre overfladeproteinerne, således at antistoffer eller ligander imod ikke-virale receptorer er blevet indbygget i den virale kappe (2, 10, 15).

En anden ulempe ved de viralt baserede vektorsystemer er, at kloningskapaciteten ofte er ret begrænset (for AAV 4,5 tusind basepar (kbp) og for adenovirus 7 kbp DNA) (3, 4, 16). Kloningskapaciteten er defineret som den maksimale størrelse af fremmed DNA/RNA, der kan indsættes i en virusvektor, uden at evnen til, at virusen kan pakkes, mistes. I produktionen af en rekombinant virus er sidste trin, at virusvektoren/genomet pakkes ind i en kappe af virale proteiner, og her er der en fysisk grænse for, hvor stor virusvektoren kan være. Dog er kloningskapaciteten i den adenovirus- vektor, der har fået fjernet mest muligt af det virale genom, forholdsvis stor, idet der kan indsættes op til 37 kbp fremmed DNA (13).

Endelig er produktionen af virus ofte besværlig og bekostelig, idet der kræves udvidede sikkerhedsforanstaltninger (3) (Boks 1).

Non-virale vektorer

Alternativet til at basere genterapi på et viralt vektorsystem er at anvende et non-viralt vektorsystem. Fordelene ved non-virale vektorer er, at de er nemme og billige at producere, har en stor kloningskapacitet og sjældent er immunogene. De non-virale vektorer kan enten administreres som nøgent DNA eller som DNA bundet til lipider, polykationer, en ligand eller en kombination af disse. De to mest anvendte non-virale systemer er liposomer og polykationer. Disse systemer udviser ingen cellespecificitet, idet deres optag er baseret på endocytose (afsnøring af cellemembranen), efter at de henholdsvis er fusioneret med (liposom) eller elektrostatisk er bundet til (polykation) cellemembranen på alle celletyper (9, 17, 18). Det er forsøgt at løse problemet med den manglende specificitet ved at koble DNA sammen med en specifik ligand (protein eller andet molekyle, der binder til en receptor). DNA og liganden kobles ved hjælp af et DNA-bindende molekyle fx poly-l-lysin eller PEI (polyethylenimin) i et såkaldt molekylært kompleks. Herved øges den receptormedierede optagelse af vektoren i cellerne (Fig. 1). Dette er dog ikke tilstrækkeligt til at opnå et funktionelt system. Når vektoren er optaget i cellen, skal den frigives fra den endosomale vesikel, der ellers normalt fører sit indhold til nedbrydning. For at øge frigivelsen af vektoren fra endosomet er det nødvendigt at tilføje en endosom-frigivende faktor. En hyppig anvendt faktor er adenovirus, som i sin virale kappe indeholder proteiner, der kan nedbryde endosomet. Det ufordelagtige ved at bruge adenovirus er, som omtalt, at komplekset derved bliver immunogent. Alternativt kan PEI anvendes, idet PEI forårsager en pH-ændring i endosomet, hvorved det svulmer op og sprænges. På denne måde får PEI en dobbelt funktion, både som DNA-bindende molekyle og som endosom-lyserende faktor (8, 19).

Et andet uløst problem er en ineffektiv transport af vektorkomplekset ind over cellens kernemembran, idet optagelsen i cellekernen afhænger af, hvilken cellecyklusfase cellen befinder sig i. Det har vist sig, at non-virale komplekser optages bedst i aktivt delende celler, hvor kernemembranen er nedbrudt i en periode (20). For at løse dette problem er det forsøgt at tilføje et nukleart lokaliseringspeptid til komplekset, hvilket resulterer i en væsentlig øget transport igennem kernemembranen, også i celler der ikke var i deling (21) (Boks 2).

Targeting

At være i stand til at ramme specifikke celler er en grundlæggende forudsætning for udviklingen af (nye) effektive systemer til genterapi. Targeting kan foregå på flere niveauer; i transporten af vektorer ind over den cellulære plasmamembran, men derudover også i det efterfølgende intracellulære forløb, fx i forbindelse med ekspressionen af det terapeutiske gen.

Receptorer

Receptorernes funktionalitet spiller en afgørende rolle i forbindelse med targeting. Dette er bl.a. blevet påvist i studier med epidermal growth factor (EGF)-receptoren, hvor resultaterne viste, at receptorens funktionalitet var en mere betydende faktor end det aktuelle antal af cellulære receptorer (20, 22). Det er endvidere vist, at hvis genmaterialet kobles til receptorbindende ligander, såsom EGF eller transferrin, der binder til transportkompetente receptorer, øges optaget af komplekset væsentligt (Fig. 1) (20).

Promotorspecificitet

Idet der endnu ikke er fundet en funktionel receptor, som udelukkende findes på tumorceller, er det nødvendigt at indføre endnu et specificitetstrin. Det kan opnås ved at indsætte en tumorspecifik promotor i vektoren. En promotor er en DNA-sekvens, der ligger umiddelbart foran et gen, og denne sekvens kontrollerer, hvorvidt der sker en produktion af det terapeutiske genprodukt. Alt afhængig af hvilken DNA-sekvens promotoren består af, vil den være aktiv i forskellige celletyper. Ved at indsætte en promotorsekvens i vektoren, der kun er aktiv i tumorceller, opnås der udelukkende en produktion af det terapeutiske genprodukt i tumorceller.

Indtil videre har det ikke været muligt at finde en promotor, som generelt er spe cifik for cancer, og som derved kunne bruges til at ramme alle former for cancer. Det mest sandsynlige er, at der skal findes en specifik promotor for hver cancertype, som muligvis også er aktiv i de metastaser, der opstår fra primærtumor (23).

Dobbelt-specifikke promotorer

Hvis det viser sig, at det ikke er muligt at finde en promotor, der udelukkende er aktiv i tumorceller, så kan et alternativ være at sikre, at nogle bestemte forhold skal være til stede i cellen, førend det terapeutiske gen kan blive udtrykt (23). En forudsætning kan fx være, at tumor-suppressorgenet, TP53, skal være muteret (defekt) i en celle, førend det terapeutiske gen bliver udtrykt, hvilket hyppigt forekommer i humane tumorer (24). TP53 koder for transkriptionsfaktoren p53, der er et protein, som binder til en bestemt promotorsekvens (en p53-promotor) og derved aktiverer promotoren. I Fig. 2 ses et eksempel på en vektor med denne ekstra specificitet. Vektoren i figuren indeholder to forskellige promotorer, der kontrollerer hver sit gen. Den første promotor er en p53-promotor, der kun aktiveres, hvis der er vildtype (wt-p53) til stede i cellen. Den anden promotor er en »tumor-specifik« promotor, der desværre også udviser lidt aktivitet i nogle normale celler. Når en normal celle, der indeholder wt-p53, modtager vektoren, vil wt-p53 binde sig til og aktivere p53-promotoren, der skal kontrollere produktionen af Cre-rekombinase. Produktionen af Cre-rekombinasen medfører en destruktion af den »tumor-specifikke« promotor, der kontrollerer ekspressionen af det terapeutiske gen. Hvis derimod en tumorcelle, hvori p53 er muteret, modtager vektoren, så vil p53-promotoren ikke blive aktiveret, og der vil ikke blive produceret Cre-rekombinase. Resultatet er, at den »tumor-specifikke« promotor forbliver intakt og kan aflæse det terapeutiske gen (15).

Terapeutiske gener

Mange forskellige terapeutiske gener har været afprøvet i forbindelse med udviklingen af genterapi imod cancer. Disse har enten været baseret på direkte eller indirekte at skulle slå tumorcellen ihjel, eller alternativt at hæmme eller reparere den transformerende genetiske defekt (15, 18).

Tumorcellerne kan (direkte) slås ihjel ved at introducere et gen, der koder for et toksin, fx Pseudomonas B-toksinet. Risikoen ved denne metode er, at en eventuel overproduktion af det toksiske genprodukt ikke kan kontrolleres, hvis genet bliver overført til andre celler end dem, behandlingen er rettet imod. Alternativt kan tumorcellerne (indirekte) slås ihjel ved, at der introduceres et gen kodende for et prodrug-aktiverende enzym. Når prodrug efterfølgende administreres til patienten, dør de celler, der har optaget genet. Herpes simplex virus-thymidinkinase er et eksempel på et prodrug-aktiverende enzym, der virker i kombination med gangcyclovir (en nukleotid-analog). Med denne metode kan behandlingen bedre kontrolleres og eventuelt afbrydes, hvis der skulle opstå komplikationer (15, 18).

I tumorer med aktiverede onkogener kan denne defekt genoprettes ved at introducere et gen, hvis produkt hæmmer det specifikke onkogen; antisense-molekyler eller ribozymer er eksempler på sådanne hæmmere. I de tilfælde, hvor de genetiske defekter har ført til mutation af et tumor-suppressorgen, kan funktionen heraf genoprettes ved at introducere en vildtype-version af genet (15, 18). Forsøg med reintroduktion af vildtype-tumor-suppressorgenet, TP53, førte til en reduktion i væksten af tumorcellerne, samt øget celle død både in vitro og in vivo (25, 26).

Bystander-effekten

Uafhængigt af hvilket terapeutisk gen, der vælges til en genterapi imod cancer, er der stadig problemer med det føromtalte ineffektive optag af vektorer i tumorerne. I bestræbelserne på at opnå en succesfuld genterapi er opmærksomheden blevet rettet imod et fænomen, der spiller en central rolle for at opnå komplet respons hos patienterne. Dette fænomen benævnes bystander-effekten. Effekten består i, at der i celler, der ikke har optaget vektorer, forekommer et respons (typisk apoptosis), der ligner det tilsigtede respons, som opnås i celler, der har optaget vektorer. Bystander-effekten medvirker derfor til et forøget respons, uden at optagelseseffektiviteten er forøget. Fænomenet skyldes formentlig transport af toksiske stoffer fra celler, der har optaget vektorer, til celler, der ikke har optaget vektorer, via celle til celle-kommunikationsveje, såsom gap-junctions (27). Bystander-effekten har bevirket, at man i musemodeller har opnået komplet respons, i situationer hvor kun 10% af cellerne har optaget genterapivektoren (28). Ingen nuværende kliniske protokoller har opnået over 10% optagelseseffektivitet (27), og man er derfor meget afhængig af denne bystander-effekt, hvis genterapi skal kunne anvendes i patientbehandling.

Slutbemærkninger

Effektiv genterapi til cancerpatienter vil sandsynligvis være mulig om nogle få år, fordi den nye teknologi gør det muligt at løse de problemer, der er beskrevet i det foregående. Terapien kan i bedste fald træde i stedet for allerede eksisterende behandling, men mere realistisk opfattes som et supplement til anden anti-neoplastisk behandling. Terapien hviler på såvel genotypisk som fænotypisk viden om den enkelte patients tumor. Da denne er karakteriseret ved forskelle fra tumortype til tumortype samt forskelle mellem celler inden for den enkelte tumor, skal man ikke forvente at kunne udvikle et universelt system, der kan anvendes til alle. I den overordnede terapistrategi må man derfor vælge, at der udvikles lægemidler, der følger samme princip, men hvor de enkelte elementer sammensættes forskelligt baseret på den enkelte tumors biologiske karakteristika. I den kliniske hverdag vil det blive en individualiseret behandling, der integrerer den grundvidenskabelige forskning i den daglige klinik.

Correspondence: Hans Skovgaard Poulsen, Strålebiologisk Laboratorium og Odin Medical A/S, Rigshospitalet, afsnit 6321, Blegdamsvej 9, DK-2100 København N.

E-mail: hsp@odin-medical.com

Antaget den 16. november 2001.

H:S Rigshospitalet, strålebiologisk laboratorium og Odin Medical A/S.

1. Michael SI, Curiel DT. Strategies to achieve targeted gene delivery via the receptor-mediated endocytosis pathway. Gene Ther 1994; 1: 223-32.
2. Wickham TJ. Targeting adenovirus. Gene Ther 2000; 7: 110-4.
3. Lukashok SA, Horwitz MS. New perspectives in adenoviruses. Curr Clin Top Infect Dis 1998; 18: 286-305.
4. Graham FL, Prevec L. Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines. Biotechnology 1992; 20: 363-90.
5. Kalpana GV. Retroviral vectors for liver-directed gene therapy. Semin Liver Dis 1999; 19: 27-37.
6. Chowdhury JR. Foreword: prospects of liver cell transplantation and liver-directed gene therapy. Semin Liver Dis 1999; 19: 1-6.
7. Berns KI, Bohenzky RA. Adeno-associated viruses: an update. Adv Virus Res 1987; 32: 243-306.
8. Cristiano RJ, Roth JA. Molecular conjugates: a targeted gene delivery vector for molecular medicine. J Mol Med 1995; 73: 479-86.
9. Mountain A. Gene therapy: the first decade. Trends Biotechnol 2000; 18: 119-28.
10. Palu G, Bonaguro R, Marcello A. In pursuit of new developments for gene therapy of human diseases. J Biotechnol