Akademisk afhandling
Hereditary deficiency of anticoagulant protein C - identification of mutations and characterization of their influence on biosynthesis of protein C
31. okt. 2005
2 min.
Doktordisputatsen omfatter fem originale publikationer og en sammenfattende redegørelse. Det eksperimentelle arbejde er udført på Klinisk Biokemisk Afdeling, H:S Rigshospitalet.
Protein C er et antikoagulant protein i plasma, der beskytter mod uhensigtsmæssig blodpropdannelse. Det er proenzym for en serinproteinase, der udøver sin antikoagulante funktion ved degradation af to prokoagulante proteiner. Syntesen af protein C sker i hepatocytterne og er karakteriseret ved ko- og posttranslatoriske modifikationer omfattende bl.a. vitamin K-afhængig γ-karboxylering af glutaminsyreenheder i den NH2 -terminale del af proteinet med efterfølgende fraspaltning af et propeptid.
Arvelig protein C-mangel (heterozygoti) forekommer med en prævalens på 0,2-0,5% i den almene befolkning og øger risikoen 5-10 gange for venøs tromboemboli med symptomdebut fra pubertetsalderen. Homozygote tilfælde er sjældne og fører til alvorlig neonatal tromboemboli eller til symptomer som hos heterozygote.
Formålet med arbejdet var at identificere mutationer i protein C-genet associeret med protein C-mangel samt at karakterisere mutationers indflydelse på biosyntese, struktur og funktion af protein C.
Der blev identificeret 22 forskellige mutationer blandt 29 indekspatienter (28 heterozygote og en homozygot) med symptomatisk protein C-mangel. Resultaterne viste mutationsspektret og demonstrerede, at gendiagnostik er et værdifuldt supplement til proteinkemiske undersøgelser af protein C i plasma ved diagnostik af arvelig protein C-mangel.
Karakterisering af oprenset protein C fra plasma fra en patient, der er heterozygot for en propeptidmutation (Arg-1His), viste afvigende propeptidprocessering med syntese af et normalt γ-karboxyleret protein C-molekyle forlænget med en aminosyre (His), hvilket er foreneligt med den påviste protein C-mangel. In vitro-ekspression af mutant protein C (Asp180Gly og Ser270Leu) i mammale celler og computeranalyse af mutantprotein C (Asp180Gly) viste resultater, der underbygger, at missensmutationer kan føre til defekt foldning af mutantprotein og intracellulær degradation før sekretion. Karakterisering af en splice site -mutation (Gln184His) ved nukleotidsekvensbestemmelse af DNA-fragmenter genereret ved PCR-amplifikation af revers transkriberet ektopisk mRNA fra lymfocytter fra familiemedlemmer heterozygote for Gln184His-mutationen viste afvigende splicing af exon 6 til exon 8, hvilket resulterer i frameshift og introduktion af et præmaturt stopcodon. Det afvigende mRNA resulterer formentlig i syntese af defekt protein C, der degraderes intracellulært før sekretion.
Arbejdet danner basis for videre udforskning af mekanismerne bag genmutationers indflydelse på biosyntese af pro-teiner samt på struktur og funktion af protein C og homologe proteiner.