Jagten på de genetiske determinanter for de formodede polygene former for type 2-diabetes

Ud fra studier af familier med ophobning af type 2-diabetes (T2D), studier af sygdomsprævalensen i blandede populationer af etniske grupper med høj og lav diabetesrisiko og især fra tvillingestudier er der betragtelig, indirekte evidens for genetiske faktorers indflydelse på udviklingen af T2D. Omkring 5% af T2D er monogene sygdomme og omfatter maturity onset diabetes of the young (MODY), maternal inherited diabetes and deafness (MIDD) og flere forskellige insulinresistens-syndromer. Imidlertid er identiteten og antallet af gener involveret i de fleste tilfælde af T2D endnu ikke kendt. Ved de hyppigste former for T2D er arvegangen ikke afklaret. Teoretisk er ren polygen arvegang, monogen arvegang med varierende penetrans eller forskellige kombinationer heraf mulige modeller. Gennem de seneste år har overvejende to strategier været anvendt i bestræbelserne på at lokalisere og karakterisere gener, der bidrager til udvikling af T2D: kandidatgenanalyse baseret på viden om det pågældende proteins fysiologi og biokemi og positionel kandidatgenanalyse, der er baseret på genomkortlægning og kromosomale koblingsstudier.

Kandidatgenanalyse baseret på viden om biokemi og fysiologi

Gener udvælges ud fra fysiologiske og biologiske overvejelser om genproduktets mulige involvering i udviklingen af T2D. For eksempel er gener, hvis genprodukt er involveret i insulinsekretion, insulinsignalering eller energiomsætning, og hvor knock-out af genet i mus viser diabetisk fænotype, traditionelt opfattet som kandidatgener. Studierne inkluderer kloning af genet efterfulgt af analyse for mutationer. Genetiske polymorfier testes i associationsstudier for direkte sygdomsassociation ved at sammenligne allelfrekvensen blandt patienter med T2D med frekvensen blandt raske kontrolpersoner eller for genotype-fænotype-korrelationer, hvor der undersøges for association mellem varianten og en intermediær fænotype af T2D, typisk en kvantitativ variabel som fx estimater af insulinfølsomhed, insulinsekretion eller adipositas. Der er inden for det seneste årti publiceret et betragteligt antal studier af kandidatgener for T2D. Eksempler på polymorfier, der har vist association med T2D eller prædiabetiske fænotyper, er vist i Tabel 1. Imidlertid har kun få associationer kunnet repliceres i efterfølgende studier, hvilket der sandsynligvis er flere årsager til. Et af associationsstudiernes store problemer er falsk positive (og negative) resultater enten pga. statiske type I-fejl (og type II-fejl) eller populationsstratifikation, dvs. case- og kontrolgrupper er ikke tilstrækkelig sammenlignelige med hensyn til faktorer, der influerer den undersøgte fænotype, fx køn, alder, BMI eller etnicitet. En mere udbredt anvendelse af familiebaserede associationsstudier vil imidlertid kunne minimere problemerne med populationsstratifikation. Enkelte polymorfier, påvist ved hjælp af den biokemibaserede kandidatgenmetode, synes dog at være impliceret i patogenesen til T2D. Sulfonylurinstofreceptor 1 (SUR1), som er receptor for lægemidler tilhørende sulfonylurinstofgruppen, udgør sammen med den associerede K+ -kanal (KIR6.2) den ATP-følsomme kaliumkanal, der spiller en central rolle i sekretionen af insulin fra β-cellen. Case-kontrol studier i adskillige etniske populationer har vist association mellem enkelt nukleotid-polymorfier i exon 16 splice acceptor site (konserveret intronsekvens-motiv der definerer overgangen mellem afslutning af exon og start af intronsekvens) og exon 18 af SUR1-genet og T2D. Blandt danskere er kombinationen af de anførte enkelt nukleotid-polymorfier således forbundet med en signifikant øget risiko for T2D (odds ratio: 3,7) (1). Endvidere er samme risikogenotype blandt unge raske danskere associeret med henholdsvis 50% og 40% reduktion i serum-C-peptid- og insulinrespons efter stimulation med tolbutamid under en intravenøs glukosetolerancetest (1). Det er imidlertid fortsat uafklaret, om disse enkelt nukleotid-polymorfier i SUR1-genet per se er involveret i patogenesen til T2D eller er markører for en endnu ukendt funktionel variant i nærheden af SUR1-genet. Også peroxisomproliferation-aktiveret receptor-γ (PPAR-γ)-genet, der koder for en nuklear receptor impliceret i lipidmetabolismen og glukosehomeostasen, er involveret i patogenesen til T2D. En Pro12Ala-polymorfi (bærefrekvens ca. 28%) er påvist i flere etniske populationer, også blandt danskere (2). En hyppig aminosyrepolymorfi, Gly482Ser i den tilhørende transkriptionale koaktivator, peroxisomproliferation-aktiveret receptor gamma coaktivator-1 (PGC1), synes ligeledes at være associeret med T2D (3).

Positionel kandidatgenanalyse

Et nylig publiceret studie af Bell et al repræsenterer et gennembrud i de seneste års positionelle kloning af gener involveret i polygene sygdomme som T2D (4). Studiet er baseret på resultatet af den første genomscanning udført med multiple, informative DNA mikrosatellit-markører inden for T2D (mikrosatellit: DNA polymorfier bestående af et variabelt antal repetitive nukleotid sekvenser). I en population af 330 mexicansk-amerikanske søskendepar med T2D påvistes i 1996 kobling mellem T2D og et område på kromosom 2 (2q37), benævnt NIDDM1 (5). Området blev estimeret til at indeholde 1,7 million basepar. I det kromosomale locus blev der fundet syv kendte gener og 15 EST (expressed sequence tags = udtrykte dele af ukendte gener), men ingen af disse var oplagte kandidatgener for T2D. Ved at undersøge 214 enkelt nukleotid-polymorfier i området, blev der påvist association og kobling mellem fem af disse og T2D, hvorfor man konkluderede, at genet i NIDDM1-regionen måtte være lokaliseret i nærheden af disse fem enkelt nukleotid-polymorfier. Efterfølgende sekventering viste, at diabetesgenet i NIDDM1-regionen var CAPN10, der koder for calpain 10, en cysteinprotease, der er udtrykt i mange forskellige væv inklusive pancreas og skeletmuskulatur. Funktionen af calpain 10 i relation til glukosehomeostasen er stort set ukendt, og resultater fra studier af CAPN10-knockoutmus foreligger ikke. Kun polymorfier i intronregioner af genet i bestemte kombinationer (haplotyper) viste association med T2D. Det er således vanskeligt at konkludere, om CAPN10 i sig selv er et diabetesgen, eller om de associerede haplotyper er markører for en anden biologisk aktiv variant i samme gen eller et endnu ukendt gen i den samme kromosomale region. Imidlertid viste Bells gruppe i samme arbejde, at en af intronvarianterne sandsynligvis er lokaliseret til et cis-aktiverende element (regulatorisk DNA-sekvens der kontrollerer et gen på samme kromosom), som influerer CAPN10-transkription, og Baier et al (6) har efterfølgende blandt Pima-indianere vist, at CAPN10-intronvariantbærere har 53% reduktion i CAPN10- mRNA i skeletmuskulaturen, og at den nedsatte genekspression var korreleret til nedsat glukoseoxidation.

CAPN10 er det første gen fundet ved genomkortlægning og positionel kloning ved T2D, og arbejdet er et skoleeksempel på anvendelse af den pågældende strategi. Gennem de sidste fem år har flere forskningsgrupper verden over foretaget genomscanninger i forskellige etniske grupper (Tabel 2). I en anden studiepopulation af mexicansk-amerikanske søskendepar med T2D påvistes kobling til kromosom 3p (LOD-score 3,9) (logarithm of odds. 10-tals logaritmen af odds ratio for at påvise kobling mellem den undersøgte fænotype og den kromosomale markør. Lod-score³3,6 anses i genomscanninger af komplekse sygdomme for at være signifikant evidens for kobling), hvilket dog ikke kunne repliceres i et andet datasæt (LOD <0,1) (7) (Tabel 2). Hverken i dette eller i et tredje studie af mexicansk-amerikanske søskendepar (8) var der evidens for kobling til 2q37. Blandt Pima-indianere er der fundet kobling mellem adskillige kromosomale loci og T2D/relaterede fænotyper i særskilte studier, men de ansvarlige gener er endnu ikke fundet. Blandt kaukasiere samler der sig størst interesse om kromosom 12q og 20q, hvortil der er påvist kobling i flere uafhængige studier. Den hidtil største genomscanning med inklusion af 719 afficerede søskendepar fra 477 familier bekræftede koblingen til kromosom 20q men ikke 12q (9). På 20q ligger MODY1-genet, hepatocyt nuklear faktor (HNF)-4α, der imidlertid ved mutationsanalyser i flere populationer er udelukket som forklaring på koblingen. MODY3-genet, HNF-1α er beliggende på kromosom 12q og er muligvis også impliceret i udviklingen af T2D, da en Ala98Val-variant blandt midaldrende danskere er associeret med nedsat insulinsekretion (10).

Konklusion og fremtidsperspektiver

T2D er den hyppigste endokrine sygdom. Det er sandsynligt, at den genetiske komponent i patogenesen til størstedelen af T2D består af en række hyppige enkelt nukleotid-polymorfier, hver især med forskellig indflydelse på sygdomsudviklingen, interagerende med hinanden og med miljøfaktorer. Hvordan identificeres disse enkelt nukleotid-polymorfier? Der er ingen tvivl om, at information om hele det humane genoms sekvens, som forventes at foreligge i detaljer inden for få år, vil facilitere arbejdet, efter der er etableret evidens for kobling til specifikke kromosomale områder. Men som det er illustreret ved de mange genomscanninger, der indtil nu er publiceret, vil hovedproblemet fremover bestå i at lokalisere de kromosomale områder, der disponerer til T2D. Mangel på replikation af initiale koblingsfund må i mange tilfælde antages at være forårsaget af utilstrækkelig statistisk styrke. Effekten af det enkelte locus (gen) er ukendt, men i mange tilfælde formentlig lav. Der er sandsynligvis også vigtige etniske forskelle. En amerikansk kollega, som er aktiv inden for T2D genetik, udtalte forleden: »Like true love, true linkage remains hard to find«. Lignende konklusioner har ført til satsning på hel genom associations studier, hvor tusindvis af T2D-patienter og tusindvis af kontrolpersoner undersøges ved hjælp af mikroarray-baseret chips indeholdende 100.000 eller flere enkelt nukleotid polymorfier.

Reprints: Oluf Borbye Pedersen, Steno Diabetes Center, Niels Steensens Vej 2, DK-2820 Gentofte.

Antaget den 12. december 2001.

Steno Diabetes Center, Hagedorn Forskningsinstitut, Gentofte, og

H:S Hvidovre Hospital, endokrinologisk afdeling.