Malariadiagnostik

Malaria fremkaldes af de fem humanpatogene malariaparasitter, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae og P. knowlesi. Infektioner med P. falciparum kan på få dage fra symptomdebut udvikle sig til en livstruende tilstand med koma, anæmi, metabolisk acidose og organsvigt. I mere end 100 år har mikroskopi af blod været standardmetoden til diagnostik af malaria. De seneste 10-20 år er der udviklet en række alternative diagnostiske metoder, bl.a. hurtigtest til antigenpåvisning, polymerasekædereaktion (PCR) og fluorescensmikroskopi. Mikroskopi af giemsafarvede dråbe- og udstrygningspræparater er dog fortsat guldstandard. Forudsætningen for et pålideligt resultat af mikroskopien er dels, at præparaterne er fremstillet korrekt, og dels at mikroskopisten er kvalificeret. I denne artikel vil vi vise, hvor enkelt det er at fremstille gode mikroskopipræparater ved at overholde få, men essentielle regler. Afslutningsvis vil vi diskutere valg af diagnostisk metode i forskellige kliniske sammenhænge.

Indikation

Enhver febril patient, som har været i et malariaområde inden for de seneste to år, bør undersøges for malaria, uanset om der har været anvendt malariaprofylakse eller ej. Dette gælder også for patienter med anden verificeret diagnose, f.eks. septikæmi. Temperaturen kan veksle ved malaria og behøver ikke at følge et systematisk mønster. Anamnestisk feber skal derfor udløse undersøgelse uanset temperaturen på undersøgelsestidspunktet. Der skal altid udføres malariamikroskopi tre på hinanden følgende dage, før diagnosen kan afkræftes. I særlige tilfælde kan man foretage flere prøver, f.eks. ved mistanke om delvist supprimeret infektion. En detaljeret gennemgang af malariaområder findes i [1] og et interaktivt kort findes på [2].

Særlige forholdsregler

Ved mistanke om P. falciparum -infektion skal undersøgelsen altid udføres akut (dvs. som vagtprøve), og patienten skal holdes under observation, indtil svaret foreligger. Der foreligger mistanke om P. falciparum hos alle febrile patienter, der har været i et falciparumområde inden for de seneste tre måneder. Undersøgelsen kræver ingen forberedelser af patienten og behøver ikke at falde sammen med en febertop. Der er ingen risici og ingen kontraindikationer.

Procedure

Der fremstilles fire udstrygningspræparater og fire dråbepræparater (»tykke dråber«). Udstrygningspræparaterne fikseres før farvning. Derved bevares de fine strukturer i både erytrocytter og parasitter. Til gengæld er det kun muligt at betragte et enkelt lag erytrocytter, og det vil i praksis ikke være muligt at mikroskopere blod nok til at opdage infektioner med et lavt antal parasitter. For at opnå højere sensitivitet fremstilles der dråbepræparater. De består af en stor dråbe blod, som fordeles på et lille areal, tørres og farves med en hypoton farvevæske. Herved lyserer erytrocytterne, mens parasitter og leukocytter bevares og farves. På denne måde kan man bogstaveligt talt lægge 30-40 lag erytrocytter oven på hinanden og stadig se igennem. For at opnå god kvalitet af præparaterne er det afgørende at følge nogle ganske enkelte retningslinjer:

1. Materiale: kapillærblod fra øreflippen eller lateralsiden af en fingerspids, evt. hælblod hos spædbørn. Blod tilsat antikoagulans er ikke velegnet. Øret eller fingeren afsprittes, hvorefter der punkteres med en lancet. Den første dråbe blod aftørres med vat, og de efterfølgende dråber fanges på et objektglas (Figur 1 A og B). Man skal undgå, at glasset berører huden, så hudceller og -bakterier afsættes og vanskeliggør mikroskopien (Figur 1 G).

2. Dråbepræparater fremstilles ved at fange ca. 50 mikroliter blod midt på objektglasset. Dette kan enten være en frithængende dråbe, der slipper, eller afsætning af tre relativt store dråber (Figur 1B), som stadig har kontakt med huden. Når dråben er fanget på objektglasset, skal den hurtigt fordeles med en træpind (f.eks. håndtaget af en vatpind) eller et andet objektglas til et areal på ca. 1,5 × 1,5 cm (Figur 1C). Herved brydes overfladespændingen, og blodet bindes til glasset. Ved mindst mulig omrøring undgås fibrinudfældning, som vanskeliggør mikroskopi. Hvis dråbepræparatet lægges over en trykt tekst, skal man lige præcis kunne se teksten igennem, så er tykkelsen tilpas (Figur 1D). Herefter skal præparatet tørre ved stuetemperatur, hvilket varer ca. 30 minutter. Man må ikke fremskynde tørringen f.eks. med en hårtørrer eller ved at anbringe objektglassene under en lampe. Dette kan fiksere og derved ødelægge præparaterne.

3. Udstrygningspræparater fremstilles ved, at man placerer en lille dråbe blod nær den ene ende af objektglasset. Blodet spredes som til differentialtælling ved at lade et andet objektglas, vinklet 45°, fange dråben. Blodet fordeler sig nu langs objektglassets kant, hvorefter det skubbes eller trækkes i en rask, jævn bevægelse til den anden ende, fortsat i en vinkel på 45° (Figur 1E). Herved opstår der et tungeformet præparat, hvor spidsen af tungen er så tynd, at erytrocytterne ligger i et enkelt lag, side om side (Figur 1F). Det er en fordel at bruge et objektglas med afskårne hjørner til at stryge med. Præparatet tørrer hurtigt ved stuetemperatur.

4. De helt tørre præparater pakkes i transportæsker og sendes til laboratoriet.

5. Forsendelse til laboratoriet er kritisk, og man skal sikre, at prøver til akut undersøgelse når frem på få timer. I vagten skal prøveforsendelsen altid aftales telefonisk, så man undgår forsinkelse og sikrer kommunikation om et positivt resultat.

I laboratoriet, før farvningen, fikseres de tynde udstrygningspræparater, ved at man pådrypper koncentreret metanol. Derimod er det vigtigt, at dråbepræparater ikke fikseres, for at sikre at erytrocytterne lyserer under farvningen. Der fremstilles en 4% og en 8% giemsaopløsning ved at blande koncentreret giemsa med en saltfri 1/15 M fosfatbuffer, pH 7,2. Præparaterne anbringes i farvekar (Wilson-cylindre), hvor tykke dråber overhældes med 4% og udstrygningspræparater med 8% giemsaopløsning. Farvningen varer i 30 minutter, hvorefter man forsigtigt skyller med vand langs objektglassenes bagside. De ufikserede dråber kan let falde af, så dette kræver omhu. Efter farvningen lufttørres præparaterne opretstående. Hertil kan der anvendes en hårtørrer e.l.

Derefter mikroskoperes præparaterne. Man starter med dråbepræ paratet, som gennemses ved 1.000 ganges forstørrelse. Der skal gennemses mindst 200 synsfelter, før der kan afgives et negativt prøvesvar. Det svarer til ca. 20 mikroliter blod og giver således en sensitivitet på under en parasit pr. mikroliter. Hvis dråbepræparatet er for tyndt eller præget af artefakter, må man gennemse flere felter. Meget tynde eller ødelagte dråbepræparater kan ikke anvendes til diagnostisk undersøgelse, og i sådanne tilfælde skal prøven gentages omgående ved mistanke om P. falciparum -malaria - ellers den følgende dag. Ved fund af parasitter kan man herefter foretage artsbestemmelse vha. udstrygningspræparaterne (Figur 2 B, D, F og H). Dette kan være tidskrævende, hvis der kun er få parasitter, så man skal lede meget længe efter et passende antal. Med øvelse kan man lære at foretage artsbestemmelse på dråbepræparatet, hvorved man får mange flere parasitter at bedømme, men parasitterne i dråbepræparatet er noget vanskeligere at bedømme (Figur 2A, C, E og G). Dernæst afgør man, hvilke stadier af parasitten der forekommer. Endelig skal parasitæmien kvantificeres. Ved parasitæmier langt under 1% anvendes der som regel en arbitrær skala (+++, ++, +, +/-), som kan veksle mellem laboratorier. Det vigtigste er her, at klinikerne er informeret om skalaens betydning. Ved højere parasitæmi skal der foretages detaljeret tælling af udstrygningspræparatet vha. et tællegitter. Man flytter præparatet til et tilfældigt område uden samtidig at se i mikroskopet. Her tælles så alle erytrocytter og inficerede erytrocytter inden for gitteret. Dette gentages, til der er talt mindst 400 og gerne 1.000 erytrocytter, og parasitæmien udtrykkes i procent inficerede erytrocytter. Det er vigtigt ikke at se i mikroskopet, når der flyttes mellem felterne, fordi man ellers ubevidst vil vælge felter med parasitter og derved overvurdere parasitæmien.

Mikroskopien giver således en sikker arts- og stadiebestemmelse og en præcis kvantificering af parasitæmien. Dette har stor klinisk betydning. P. falciparum er som omtalt langt den alvorligste og er endvidere ofte resistent over for chloroquin. P. vivax og P. ovale har et dormant leverstadie, hypnozoitten, som kan give anledning til recrudescens måneder til år efter det primære anfald, og som ikke fjernes ved rutinebehandling for malaria, men kræver efterbehandling med primaquin. Ved falciparum -malaria er det også vigtigt at bedømme parasitæmien. Ved mere end 5% inficerede erytrocytter er der stor risiko for livstruende komplikationer, hvorfor man behandler med intravenøs quinin, mens lavere parasitæmier behandles oralt, medmindre der er kliniske kom-plikationer. Kvantificeringen gør det også muligt at følge behandlingsresponset, hvilket altid skal gøres dagligt for P. falciparum, til alle parasitter er væk samt ved efterfølgende en- og fireugerskontrol.

Alternative metoder til malariadiagnostik er fluorescensmikroskopi, antigenpåvisning og PCR. Fluorescensmikroskopi giver ingen markante fordele og vil ikke blive omtalt yderligere. Antigenpåvisning med kromatografiske metoder har god sensitivitet for P. falciparum og til dels for P. vivax ved parasitæmier med over 100 parasitter pr. mikroliter. Med nogle metoder kan man skelne P. falciparum fra de øvrige Plasmodium spp. Derimod er antigenpåvisninger ikke kvantitative, de kan ikke anvendes til stadieinddeling, og de fleste kan ikke anvendes som behandlingskontrol, da de forbliver positive i dage til uger efter endt behandling. Vi har i et nyligt publiceret studie [3] påvist, at antigenpåvisning kan anvendes til akut diagnostik på sygehuse uden adgang til vagtmikroskopi under følgende forudsætninger:

1. Testen skal udføres af dedikeret personale som hovedregel på et laboratorium.

2. Et positivt fund skal omgående afstedkomme mikroskopi, enten ved indkaldelse af en mikrobiolog eller ved at overflytte patienten til et sygehus med vagtberedskab. Dette skal sikre, at parasitæmien kvantificeres, og artsdiagnosen bekræftes før behandling.

3. Et negativt fund skal efterfølges af mikroskopi for malaria de tre efterfølgende dage som rutineprøve.

Antigentest er også nyttig i udbrudssituationer, f.eks. krise- og krigstilstande, hvor der ikke er adgang til mikroskopi. Endelig promoverer Verdenssundhedsorganisationen brug af antigentest til diagnostik af malaria i endemiske områder, hvor resistens gør det nødvendigt at anvende behandlinger, der økonomisk belaster den fattige lokalbefolkning [4]. Diskussionen af fordele og ulemper ved denne anbefaling falder uden for denne artikels formål.

PCR-metoder er særdeles sensitive og kan anvendes på opbevaret blod, f.eks. indtørret blod på filterpapir, indsamlet under feltarbejde. PCR-metoder er endvidere nyttige til undersøgelse af resistensmutationer og til behandlingskontrol i områder med hyppige reinfektioner [5]. Der findes realtids-multiplex -PCR-metoder, som kan give et semikvantitativt resultat, men nøjagtig kvantificering af parasitæmien, som er yderst relevant ved valg af behandling, er endnu ikke mulig. Dette kan derimod gøres vha. flowcytometri [6].

Når man tager i betragtning, hvor enkel og effektiv mikroskopi for malaria er, og at nyere metoder foreløbig ikke har tilført forbedringer af diagnostikken, må man forvente, at mikroskopi for malaria forbliver standardmetoden i endnu en række år. Det er derfor vigtigt, at alle læger kan fremstille velegnede præparater, og at ekspertise i mikroskopi samt vagtberedskab vedligeholdes i de mikrobiologiske laboratorier.

Korrespondance: Jørgen A.L. Kurtzhals, Klinisk Mikrobiologisk Afdeling 7602, Rigshospitalet, DK-2200 København N. E-mail: jkcmp@rh.dk

Antaget: 1. april 2008

Interessekonflikter: Ingen

Retningslinjerne er godkendt af Dansk Selskab for Klinisk Mikrobiologi.