MAP-kinaser - molekylære transistorer i dyr og planter

Kommunikation mellem celler og deres evne til at respondere på ydre påvirkninger er fundamentale for en organismes overlevelse. Forståelse af cellulær signaloverførsel er derfor et stort mål for molekylærbiologisk forskning. MAP-kinaserne udgør en af de vigtige grupper af proteiner, der fungerer under signaloverførsler. MAP-kinaser er fundet i mange forskellige eukaryote organismer, hvor de varetager centrale opgaver i forskellige signalprocesser. Genetisk forskning i pattedyr har påvist vigtige MAP-kinasefunktioner under kontrol af programmeret celledød i hjernen og i immunforsvarets aktivering og har ydermere vist, at de samme MAP-kinaser under styringen af disse processer både kan fungere aktiverende og hæmmende. Overraskende nok indgår MAP-kinaser også i kontrollen af planters immunsystem, og også her kan de indtage dobbeltroller som både positive og negative regulatorer. Disse mekanistiske ligheder åbner mulighed for frugtbar begrebsmæssig udveksling mellem molekylærbiologisk forskning i dyr og i planter.

Medicin og botanik var oprindelig nært forbundne videnskaber. De fleste lægemidler var planteprodukter, og medicinsk kunnen bestod derfor langt hen ad vejen i at kende de planter, der kunne lindre forskellige lidelser. Endnu i dag anvendes flere plantebaserede lægemidler, der enten virker direkte mod patogener eller modulerer vore egne fysiologiske processer, som fx dele af vores immunsystem. Planters indvirkning på vores immunsystem er derfor et gammelt tema. At planter selv besidder et effektivt immunforsvar mod angreb fra patogener som bakterier, svampe og vira er derimod først blevet kendt gennem specielt sidste halvdel af det 20. århundrede.

Helt ny er opdagelsen af, at både planter og dyr benytter en fælles klasse af signalmolekyler, MAP-kinaserne, når deres immunforsvar skal aktiveres. MAP-kinaserne blev op gennem 1990'erne kendt som centrale regulatorer af fx celledeling, programmeret celledød og T-celledifferentiering. Udvikling af lægemidler rettet specifikt mod MAP-kinaser er derfor i dag et stort tema i den farmakologiske industri. Vi vil her fokusere på genetisk analyse af MAP-kinasers funktion i pattedyr og planter med særlig vægt på de ligheder, der tegner sig både mekanistisk og fysiologisk. Som fundament vil vi starte med at gennemgå de basale molekylære mekanismer, MAP-kinaserne benytter, når de modtager og viderebringer cellulære signaler.

Kaskader og stilladser

Opretholdelse af en flercellet organismes integritet er betinget af kommunikation mellem cellerne og af cellernes evne til at indstille sig efter ydre påvirkninger. Denne kommunikation varetages i vid udstrækning af kemiske budbringere (fx hormoner), der igangsætter cellulær signalering ved binding til specifikke receptorer i cellemembranen. Inde i cellerne føres signalet videre, ofte til kernen hvor der fx kan ske ændringer af genekspression. Det er i denne signaloverførsel, at MAP-kinaserne træder ind som hovedaktører (Fig. 1 ).

Den først fundne MAP-kinase blev isoleret som en proteinkinase, hvis aktivitet steg voldsomt efter behandling af pattedyrceller med celledelingstimulerende vækstfaktorer, og blev derfor kaldt mitogen-activated protein-kinase , MAP-kinase (1, 2). Senere er nære slægtninge til denne MAP-kinase, der nu benævnes ERK1, isoleret fra mange forskellige eukaryote organismer såsom gær, bananflue og planter.

Proteinkinaser katalyserer fosfatoverførsler fra adenosintrifosfat (ATP) til et protein. Herved ændres proteinets aktivitet fx som følge af de strukturændringer, der induceres af introduktionen af negativ ladning fra fosfatgruppen på proteinet. Ofte er aktivitetsændringen under fosfatoverførsel drastisk, og fosfatoverførsler kan derfor virke lidt som transistorer i elektriske kredsløb: Enten er aktiviteten helt slukket eller helt tændt, en egenskab der er meget velegnet til signaloverførsel.

MAP-kinaserne ændrer ikke bare andre proteiners aktivitet ved fosfatoverførsel. De bliver også selv aktiveret ved fosfatoverførsel, og MAP-kinasernes aktivatorer bliver igen aktiveret ved fosfatoverførsel. MAP-kinaser virker altså som det sidste led i en tredelt fosfatoverførselskaskade , hvis komponenter tilsvarende kaldes MAP-kinaser (MAPK), MAP-kinase-kinaser (MAPKK) og MAP-kinase-kinase-kinaser (MAPKKK) (Fig. 1B ).

Kaskadesignaleringen har to vigtige konsekvenser. For det første fører aktivering af et enkelt molekyle i første led (MAPKKK-niveauet) til aktivering af mange molekyler i andet led (MAPKK-niveauet), som igen hver især aktiverer flere molekyler i tredje led (MAPK-niveauet). Kaskaden virker altså som en forstærker. Denne signalamplifikation kan imidlertid også være problematisk: Med tilstedeværelsen af 10-20 nært beslægtede typer af molekyler i hvert niveau af kaskaden i den samme celle er der mulighed for krydsreaktioner mellem fx de forkerte MAPKK og MAPK. En ukontrolleret signalamplitude kan derfor føre til aktivering af forkerte fysiologiske processer. Dette specificitetsproblem har cellen løst ved at organisere hver enkelt kaskade i kassetter holdt sammen af stilladsmolekyler (Fig. 2 ).

Stilladser kan virke på flere forskellige måder. Eksempelvis kan alle tre komponenter af kaskaden være bundet sammen indbyrdes og til deres umiddelbare op- og nedstrømsregulatorer (Fig. 2A ). Herved mistes amplifikationen helt, men til gengæld opnås høj specificitet og hurtig signaloverførsel. En anden mulighed er sekventielle bindinger. Her bindes par af forskellige kaskadeniveauer sammen, men disse bindinger brydes samtidig med aktivering af nedstrømskinasen (Fig. 2B ). Dette er en kompromisløsning, der både tillader nogen grad af signalamplifikation gennem kaskaden, men også sikrer bedre specificitet af signaloverførslen end i det helt frie tilfælde.

MAP-kinasen modtager og fordeler

Når en organisme aktiverer en fysiologisk proces, ligger der ofte en omprogrammering af cellernes genekspression til grund. Nogle gener udtrykkes langt kraftigere, mens andres ekspressionsniveau falder. Her spiller MAP-kinaserne ofte hovedroller: For det første er mange af deres substrater såkaldte transkriptionsfaktorer, der direkte styrer specifikke geners ekspression ved binding til DNA i kernen. Denne DNA-binding kan moduleres ved fosfatoverførsel fra MAP-kinasen. For det andet er det hyppigt MAP-kinasen, der so m kaskadens endelige led selv sørger for overførsel af signal fra cytoplasma til kerne: Efter aktivering kan den bevæge sig fra cytoplasma til kernen, hvor den kan aktivere eller hæmme transkriptionsfaktorer (3).

For at forstå, hvilke processer de forskellige MAP-kinaser kontrollerer, har en blanding af biokemi, genetik og fysiologi vist sig frugtbar: Biokemien afklarer, hvilke stimuli der resulterer i aktivering af de enkelte kaskader, mens genetik og fysiologi tilsammen evaluerer betydningen af disse aktiveringer ved at bestemme fysiologiske konsekvenser af mutationer i MAP-kinasegener.

MAP-kinaser i pattedyr

MAP-kinasekaskader i pattedyr omfatter de ekstracellulært regulerede kinaser (ERK), Jun N-terminale kinaser (JNK)* (* JNK blev oprindelig fundet som en proteinkinase, der fosforylerer den aminoterminale del af transkriptionsfaktoren Jun.) og p38 MAP-kinaser, der hver aktiveres af specifikke MAPK-kinaser. Biokemisk analyse har klarlagt en del af de stimuli, der ledes ind i MAP-kinasekaskaderne, og ligeledes de komponenter, som de individuelle MAP-kinaser aktiverer. ERK-MAP-kinaserne aktiveres primært under proliferering i forbindelse med vækstfaktorstimuli, mens JNK- og p38 MAP-kinaserne aktiveres af forskellige typer stress (fx osmotisk og oxidativt) samt cytokiner, der dirigerer differentiering og celledød. Mange af disse aktiveringers fysiologiske betydning er dog ikke fastsat rigoristisk gennem mutantanalyse og falder derfor uden for denne artikels fokus.

I slutningen af 1990'erne kom de første afhandlinger med beskrivelser af MAP-kinasemutationers fysiologiske konsekvenser i mus. I det følgende vil vi gennemgå et par eksempler, der både viser den fysiologiske betydning af MAP-kinaser i pattedyr og udstiller et centralt tema i MAPK-signalering: egenskaben til både at virke aktiverende og hæmmende på specifikke processer.

MAP-kinasemutanter - evidens for funktion immunforsvar og udvikling

Genetisk analyse er et af de stærkeste midler til at få en konkret viden om, hvilke processer et givet gen er involveret i. Let forsimplet lyder argumentet: Muter et bestemt gen i en organisme og kortlæg de defekter, den frembragte mutant udviser, så nøjagtigt som muligt. Konklusion: Genet varetager normalt de funktioner, der er defekte i mutanten.

Mus fungerer som genetisk modelsystem for pattedyr. Flere og flere mutationer kortlægges heri, og mus, der har et kendt gen slået ud, kaldes knockoutmus.

JNK-familien af MAP-kinaser er som nævnt involveret i stress-signalering, men først gennem analyse af effekten af mutationer i JNK -generne blev det klart, at de også spiller vigtige roller under fosterudvikling. Der er beskrevet tre JNK-kinaser, JNK1/2/3. Manglen på én af disse er ikke letal, og knockout-musene, benævnt jnk1, jnk2 og jnk3 , er umiddelbart morfologisk normale (4-6).

Dobbeltmutationen jnk1/jnk2 er derimod embryoletal og medfører stærk fejlregulering af programmeret celledød (apoptose) i hjernen (7); jnk1/jnk2 -fostre udvikler sig først normalt, men der opstår abnormaliteter i baghjernen, og det neurale rør bliver ikke lukket, så fostrene dør elleve til tolv dage gamle. Apoptose er foreslået som den mekanisme, der lukker neuralrøret (8), og netop i jnk1/jnk2 er der kun sporadisk celledød i de laterale kanter af den sammenløbne baghjerne, hvorimod der i normale fostre er en høj koncentration af celledød (7). Yderst interessant er det, at det modsatte fænomen gør sig gældende i forhjernen: Her ses et meget højt niveau af apoptose i jnk1/jnk2 -dobbeltmutanten, men kun sporadisk død i normale fostre. Ud over at være essentielle for hjernens udvikling viser dette, at JNK1 og JNK2 både kan være nødvendige for positiv og negativ regulering af samme specifikke proces, apoptose, afhængigt af cellulær kontekst.

Trods jnk1- og jnk2 -enkeltmutanternes tilsyneladende normale udvikling viste en nærmere analyse af dem, at både JNK1 og JNK2 er nødvendige for normal T-celledifferentiering. Når TH -celler aktiveres af antigenpræsenterende celler, gennemgår de klonal proliferering. De aktiverede TH -celler kan derefter enten blive TH 1- eller TH 2-effektorceller, der medierer henholdsvis det inflammatoriske og det humorale respons.

Yang et al (5) fandt, at aktiverede TH -celler fra jnk2 -mus er svækkede i dannelsen af TH 1-effektorceller i forhold til raske kontrolmus. Polariseringen af TH -celledifferentieringen er bl.a. bestemt af cytokiner som interferoner (IFN) og interleukiner (IL). IL-12 og IFNg er nødvendige for dannelsen af TH 1-effektorceller, mens IL-4 er nødvendig for TH 2-differentieringen (Fig. 3 ). Netop produktionen af IFNg er stærkt reduceret i jnk2 -T-celler. Tilsætning af IFNg under differentiering i jnk2 bragte balance i regnskabet mellem dannelsen af TH 1- og TH 2-effektorceller, der fik de samme værdier som kontrollen. JNK2 er altså en positiv regulator af produktionen af IFNg under differentieringen og er dermed nødvendig for dannelsen af TH 1-effektorceller (Fig. 3C ).

En reduceret evne til at danne TH 1-effektorceller blev ligeledes fundet for jnk1 -TH -celler. I dette tilfælde er produktionen af IFNg ikke påvirket, men derimod ses en forøget produktion af IL-4, der under aktivering skubber differentieringen af TH -celler imod TH 2-effektorceller. JNK1 er derfor en negativ regulator af IL-4-produktion, da fravær af JNK1 betyder overproduktion af IL-4 (6).

IL-4-transkription styres af transkriptionsfaktoren NFATc, og ud over at overproducere IL-4 akkumulerer aktiverede jnk1 -TH -celler NFATc i kernen. JNK1 er altså nødvendig for at ekskludere NFATc fra kernen og dermed øge differentieringen af TH1-effektorceller (6). Mekanismen bag den JNK1-styrede blokering af NFATc-kernelokalisering er fosfatoverførsel (9) (Fig. 3B ).

Også MAP-kinaser fra ERK-gruppen kan have funktioner i immunforsvaret, idet ERK1 lader til at have betydning for tymocytudvikling. Pagès et al (10) så en halvering i antallet af enkelt positive tymocytter (CD4+ eller CD8+) fra seks uger gamle erk1 -mutanter i forhold til normale mus. Ligeledes havde erk1 -musene en tilsvarende forøgelse af tymocytter, der udtrykte både CD4 og CD8.

MAP-kinaser i planteimmunitet

Planter er i besiddelse af flere latente forsvarssystemer mod infektion. I modsætning til dyr indstiller disse forsvarssystemer sig ikke efter specifikke patogener. I stedet aktiveres et bredt forsvarssystem effektivt mod både svampe, bakterier og vira efter genkendelse af et avirulent patogen, hvorved immunitet mod en bred vifte af normalt virulente patogener opnås. Samme systemer aktiveres, uanset om patogenet er en bakterie, svam p eller virus. Hvad der nøjagtigt ligger til grund for opnåelse af immunitet, vides ikke med sikkerhed, men det er dog klart, at forstærkning af cellevæggene samt forøget syntese af antimikrobielle proteiner og egentlige lavmolekylære antibiotika indgår i immunresponset.

Der er indtil videre påvist to forsvarssystemer, der bl.a. fører til syntese af forskellige sæt af antimikrobielle proteiner: Det ene medieres af salicylsyre, der ligesom dets acetylderivat har en immunsuppressiv virkning i mennesker - det andet af jasmonsyre, der er en nær kemisk slægtning til prostaglandin E2. Hvilke signaler, der er i øvrigt er ansvarlige for aktiveringen af forsvarssystemerne efter patogengenkendelsen, er næsten helt uafklaret.

En serie afhandlinger sidst i 1990'erne tydede på, at MAP-kinaser kunne være involveret i aktivering af planters forsvar. Således kunne der påvises ændringer af MAP-kinaseaktivitet under patogenangreb, og behandlinger af planter med salicylsyre førte til aktivering af en specifik MAP-kinase (11).

For at komme forståelsen af MAP-kinasesignalering i planter et skridt nærmere benyttede vi samme strategi, som viste sig frugtbar i mus: at frembringe knockout-planter med specifikke gener og analysere deres defekter. Ligesom musen er et godt modelsystem for pattedyr, fungerer gåsemad (Arabidopsis thaliana ) som planternes modelsystem - den er fx den eneste højere plante, hvis genom er fuldstændig sekventeret. For MAP-kinase 4 (MPK4) i gåsemad fandt vi et opsigtsvækkende resultat: mpk4 -mutanten udtrykker konstant det salicylsyreafhængige forsvar på højeste blus og er immun over for en stor gruppe patogener. I normale, raske planter er MPK4 aktiv, og denne aktivitet holder forsvarssystemet i ave. MPK4 fungerer altså som en negativ regulator af det salicylsyreafhængige forsvar (12) (Fig. 4 ). Videre analyse af mpk4-mutanten viste, at den er blokeret i det jasmonsyreafhængige forsvar, så den altså her lader til at udfylde en rolle som positiv regulator (12) (Fig. 4B ).

De samme temaer, som vi så for MAP-kinaser i dyr, går altså igen i planten. Ikke alene fordi MAP-kinaser også her spiller en rolle for signaleringen i immunforsvaret, men også fordi vi igen ser, at både positiv og negativ regulering kan varetages af det samme molekyle. Disse mekanistiske ligheder på det molekylære niveau er naturligvis interessante set i et bredt biologisk perspektiv. Det er bemærkelsesværdigt, at så forskellige former for flercellet liv som dyr og planter benytter sig af samme typer molekyler og mekanismer i så fundamental en proces som kontrollen af beskyttelse mod infektion.

Dette udstyrer os imidlertid også med et muligt værktøj til hurtigere at forstå vores eget immunsystem. Planter er meget lettere at håndtere genetisk end pattedyr, og fremskridtene i forståelsen af de vigtige molekylære mekanismer bag planteimmunsystemet vil derfor kunne ske hurtigere og række dybere end i pattedyr. Da der nu er en god chance for, at nogle grundlæggende mekanismer går igen i kontrollen af planters og dyrs immunforsvar, vil viden opnået i planter kunne tjene som inspirationskilde til hurtigere fremskridt i forståelsen af de tilsvarende processer i dyr. Den gamle ide om at bruge planter som lægende midler kan derfor med anvendelsen af den molekylære biologi antage helt nye dimensioner: Vi kan ikke bare bruge planterne direkte som medicin, når vi bliver syge, men måske også til at forstå, hvordan vi selv fungerer, når vi bliver syge!

E-mail: mundy@biobase.dk

Antaget den 2. oktober 2001.

Københavns Universitet, Molekylærbiologisk Institut, plantefysiologisk afdeling.