Mesenkymal stamcelleterapi - nøglen til regenerativ medicin?

Mesenkymale stamceller (MSC) findes i knoglemarven og kan blive ophav til forskellige celletyper, f.eks. osteoblaster, kondrocytter, adipocytter, endotelceller og myocytter. MSC isoleres fra knoglemarven ved hjælp af fysiske eller kombinerede fysiske og immunologiske metoder. MSC kan også isoleres fra perifert blod og fra »stroma« af mange organer. Der er gennemført flere studier, som viser, at det praktisk er muligt at anvende MSC i klinikken f.eks. i behandling af store knogle- og bruskdefekter, til gendannelse af blodkar (vaskulogenese og angiogense), i behandling af ikkehelende hudsår og ved systemisk transplantation sammen med hæmatopoietisk stamcelletransplantation eller til behandling af systemiske knoglesygdomme. Mange af disse studier er så lovende, at det kan forventes, at behandling med MSC vil blive aktuel i den nærmeste fremtid.

Mesenkymale stamceller (MSC), også kaldet marvstromale celler eller multipotente adult progenitor celler (MAPC), findes i knoglemarven blandt de ikkehæmopoietiske celler. I øjeblikket er der stor interesse for forskning i MSC-biologien, idet resultaterne i nyere studier tyder på, at differentieringspotentialet for disse celler er meget større end tidligere antaget, og at de kan anvendes i behandling af en række sygdomme.

MSC-biologien er beskrevet i en tidligere oversigtsartikel i Ugeskrift for Læger [1]. Formålet med denne nye oversigtsartikel er derfor at opdatere emnet med de nyeste forskningsresultater.

Isolation af MSC fra knoglemarven, »stromaet« af mange organer og fra perifert blod

Der anvendes forskellige metoder til isolering af hMSC fra knoglemarven. Den traditionelle metode er baseret på isolering af hMSC fra mononukleær cellefraktion af knoglemarven, ved at de adhærerer til plastikoverfladen af dyrkningsflasker [2]. Der er beskrevet flere alternative metoder til at isolere en mere homogen cellepopulation baseret på cellernes immunologiske eller kombinerede immunologiske og fysiske egenskaber [3, 4]. MSC kan også isoleres fra det stromale væv fra mange organer. For eksempel kan MSC isoleres fra fedtvæv, muskler, synovialmembraner, føtal pancreas, lever, hjerne og vaskulære elementer i mælketænder [5]. MSC kan også isoleres fra perifert blod [6] og navlestrengsblod [7].

Karakterisering af MSC

Morfologisk er MSC fibroblastlignende celler. De udtrykker ikke overfladeantigener, der er karakteristiske for hæmatologiske stamceller, men er positive for stromalcellemarkørerne Stro-1 og CD105. MSC kan in vitro og in vivo uddifferentieres til flere forskellige mesodermderiverede celletyper, inkl. osteoblaster, adipocytter, kondrocytter og myocytter, men også til ikkemesodermderiverede celletyper som neuronalceller, leverceller og insulin-producerende β -celler [8]. Den sidstnævnte proces, hvor celler kan differentiere til andre celletyper end dem, der findes i det oprindelige kimcellelag, kaldes transdifferentiering.

Klinisk anvendelse af MSC: regenerativ medicin

Regenerativ medicin er en ny medicinsk disciplin, som har
til formål at anvende stamceller til behandling af degenerative og aldersbetingede sygdomme (Fig. 1 ). På grund af en række praktiske egenskaber ved MSC er de formentlig den første stamcelletype, som vil blive anvendt i klinisk behandling. MSC-isolering er nem at foretage, og der kræves kun en knoglemarvspunktur, som er en rutineprocedure på alle medicinske afdelinger. MSC kan dyrkes in vitro i autolog eller allogen serum fra mennesker, derved kan man undgå kontaminering med mulig infektionsreagens fra dyr. MSC kan dyrkes fra patientens egen knoglemarv (autolog MSC), og der er derfor ingen risiko for immunologiske rejektioner. Endelig medfører brugen af autologe MSC (i modsætning til brugen af embryonale stamceller) ikke etiske problemer, idet det grundlæggende blot drejer sig om autolog transplantation.

Der er gennemført flere studier, som viser, at det praktisk er muligt at anvende MSC i klinisk behandling. Disse studier er typisk karakteriseret som proof-of-principle -forsøg med få patienter, uden kontrolpersoner eller randomisering. I de følgende afsnit vil vi redegøre for virkningerne af MSC ved sygdomme, hvor behandling med MSC enten allerede er afprøvet hos patienter, eller hvor de rapporterede resultater fra eksperimenter i dyremodeller er så lovende, at det kan forventes, at behandling med MSC vil blive mulig i den nærmeste fremtid.

Med MSC kan man reparere knogle- og bruskdefekter

Da MSC kan differentiere til osteoblaster, har man anvendt MSC til reparation af ikkehelende knoglebrud eller til vævsrekonstruktion efter traume. Der findes i litteraturen beskrevet flere dyrestudier, som viser, at MSC kan bruges til udbedring af knogledefekter, især efter transduktion af cellerne med gener, som fremmer knogledannelse [10], eller efter dyrkning på specielle knoglefremmende substrater [11]. Man har prøvet MSC-transplantation til reparation af store knogledefekter hos mennesker. I en kasuistisk publicering har man rapporteret om behandling med gode resultater af store knogledefekter hos tre patienter [12]. Ligeledes har man ved dyreforsøg vist, at MSC kan differentiere til kondrocytter, og at de kan anvendes til reparation af bruskdefekter [13]. Disse fund kan blive relevante i behandlingen af patienter med lokaliserede bruskskader.

MSC til etablering af nye blodkar (vaskulogenese) og muskelceller (myogenese)

Mononukleære celler fra knoglemarven (MNC) eller en subpopulation heraf, AC133+ (hæmatopoietisk stamcellemarkør), har i flere mindre, urandomiserede, kliniske sikkerhedsstudier været anvendt for at opnå vækst af kollaterale blodkar (angiogenese) eller dannelse af de novo-blodkar (vaskulogenese) efter akut hjerteinfarkt (AMI) og ved kronisk myokardieiskæmi [14-16]. Både implantation direkte i myokardiet og intrakoronar infusion af cellerne syntes at bedre hjertemusklens blodgennemstrømning og funktion. Intramyokardial injektion af skeletmuskelmyoblaster har ligeledes været rapporteret at kunne forbedre hjertes pumpeevne hos patienter med svær hjerteinsufficiens [17], men ved brug af denne celletype har det dog vist sig, at mange af patienterne fik betydende behandlingskrævende ventrikulære rytmeforstyrrelser.

I et mindre, randomiseret, klinisk studie af patienter med perifer ekstremitetsiskæmi uden yderligere medicinske og kirurgiske behandlingsmuligheder viste behandling med injektion af MNC fra knoglemarven (som indeholder MSC og også andre stamcelletyper) direkte i m. gastrocnemius at forbedre ilttensionen i benene og øge gangdistancen [18].

Man har også diskuteret, om man kan bruge MSC i behandlingen af patienter med cerebrale infarkter [19]. I en rottemodel med induk tion af cerebralt infarkt påvistes en gavnlig effekt af lokal implantation af MSC på udbredelsen af hjerneskade. Det er interessant, at de positive effekter af MSC-implantation ikke skyldtes transdifferentiering af MSC til hjerneceller, men en lokal modificerende effekt af MSC på vævsskaden.

MSC kan bruges til behandling af ikkehelende hudsår

Hos tre patienter, der havde kroniske, ikkehelende hudsår trods maksimal medicinsk og kirurgisk behandling med hudautograft, var lokal applikation af MSC både klinisk og histologisk effektiv [20].

MSC kan bruges i kombination med genterapi

MSC har vist sig at være en god vehikel til genterapi. Man overfører eksogene gener til MSC og disse genmodificerede celler kan overleve in vivo i en længere periode. For eksempel har man vist, at MSC med overført IL-3- [21] eller faktor IX-gen [22] kan producere biologisk aktive proteiner, henholdsvis IL-3 og faktor IX, over en længere periode. Man har diskuteret, om man kan transplantere disse genmodificerede celler til behandlingen af patienter med manglende eller nedsat produktion af proteiner eller hormoner.

Systemisk transplantation

Tilstedeværelsen af cirkulerende MSC kunne tyde på, at man kan anvende MSC i en systemisk transplantationbehandling, analogt med brugen af hæmopoietiske stamceller (HSC). Det er dog fortsat meget kontroversielt. Muligheden for ved MSC at krydse den vaskulære barriere in vivo er begrænset [23]. Interessant, men også meget diskutabelt, har Horwitz et al rapporteret om, at systemisk transplantation af HLA-matchet allogen MSC var effektivt hos (om end få) patienter med svær osteogenesis imperfecta [24].

Man har også undersøgt systemisk transplantation af MSC sammen med HSC mhp. at optimere det hæmopoietiske mikromiljø og hermed forbedre engrafment og regeneration af hæmopoiesen. Hypotesen er baseret på flere in vitro-studier, som har vist, at knoglemarvens stroma efter helkropsbestråling (som udføres inden HSC-transplantation) har nedsat evne til at understøtte vækst af HSC [25]. I immuninkompetente mus er det for nylig vist, at samtidig indgift af MSC og HSC øger myelo- og megakaryocytopoiesen i forhold til ved indgift af HSC alene. Dette gjaldt specielt for grafter med få HSC, hvorimod der for de større HSC-grafter ikke var nogen gevinst ved den samtidige MSC-infusion [26]. I det eneste kliniske studie, der hidtil er udført, er det vist, at koinfusion af autologe ex vivo-ekspanderede MSC kan foregå uden at påføre patienterne yderligere bivirkninger, og at kotransplantation af MSC hos disse patienter med cancer mammae, behandlet med højdosis kemoterapi og autolog HSC-transplantation, syntes at bedre den hæmopoietiske regeneration [27].

Begrænsning i brugen af MSC i behandling

Anvendelse af MSC i behandling møder to væsentlige problemer. For det første kræver anvendelsen af MSC i klinisk terapi et stort antal celler, men MSC har begrænset livslængde in vitro, og det er derfor kun muligt at få et begrænset antal celler via celledyrkning. Årsagen til dette er, at de dyrkede MSC i de fleste protokoller er telomerasenegative [28]. Induktion af et højt niveau af cellulær telomeraseaktivitet kunne forlænge livslængden for MSC in vitro og derfor give mulighed for at få et tilstrækkeligt antal celler til kliniske behandlingsprotokoller [29]. Et andet potentielt problem er den multipotentialitet (eller pluripotentialitet), som cellerne udviser. Selv om nuværende data viser, at cellernes mikromiljø begrænser cellernes differentieringsmuligheder, og at en implanteret MSC således ikke danner »teratomer« in vivo, arbejder man med at udvikle differentieringsprotokoller, som inducerer differentieringen af MSC til en bestemt celletype før transplantation.

Fremtidige perspektiver

Det forventes, at anvendelsen af MSC i den kliniske behandling af diverse degenerative og aldersbetingede sygdomme vil have fundet sin plads ved siden af den nuværende medikamentelle behandling inden for en overskuelig årrække. Stamcellebehandling kan i nogle tilfælde potentielt rette de patofysiologiske processer, som er årsag til visse sygdommes udvikling, eller udbedre vævsskader, og behandlingen er derfor et meget lovende nyt princip. En anden vigtig gevinst ved stamcelleforskning er informationer om, hvordan vi kan regulere de endogene stamcellers aktivitet og funktion i forskellige organer, så det bliver muligt at forbedre vævsregeneration og -fornyelse, og dermed undgå eller reducere de funktionstab, som er resultatet af aldring og akutte eller kroniske sygdomme.

Moustapha Kassem, Endokrinologisk Afdeling M, Odense Universitetshospital, DK-5000 Odense C.

Antaget den 29. oktober 2003.

Odense Universitetshospital, Endokrinologisk Afdeling M,

H:S Rigshospitalet, Hjertecenteret, Medicinsk Afdeling B,

Århus Universitetshospital, Århus Amtssygehus, Hæmatologisk Afdeling, og

Amtssygehuset i Herlev, Hæmatologisk Afdeling.

1. Justesen J, Stenderup K, Kassem MS. Mesenkymale stamceller. Ugeskr Læger 2001;163:5491-5.
2. Kassem M, Mosekilde L, Eriksen EF. 1,25-dihydroxyvitamin D3 potentiates fluoride-stimulated collagen type I production in cultures of human bone marrow stromal osteoblast-like cells. J Bone Miner Res 1993;8:1453-8.
3. Gronthos S, Zannettino AC, Hay SJ et al. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J Cell Sci 2003;116:1827-35.
4. Reyes M, Lund T, Lenvik T et al. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 2001;98:2615-25.
5. Miura M, Gronthos S, Zhao M et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:5807-12.
6. Kuznetsov SA, Mankani MH, Gronthos S et al. Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol 2001;153:1133-40.
7. Rosada C, Justesen J, Melsvik D et al. The human umbilical cord blood: a potential source for osteoblast progenitor cells. Calcif Tissue Int 2003;72: 135-42.
8. Ianus A, Holz GG, Theise ND et al. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion. J Clin Invest 2003;111:843-50.
9. Stem cells http://stemcells.nih.gov/stemcell/scireport.asp /Maj, 2000.
10. Peng H, Wright V, Usas A et al. Synergistic enhancement of bone formation and healing by stem cell-expressed VEGF and bone morphogenetic protein-4. J Cl in Invest 2002;110:751-9.
11. Ikeuchi M, Dohi Y, Horiuchi K et al. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 promotes osteogenesis within atelopeptide type I collagen solution by combination with rat cultured marrow cells. J Biomed Mater Res 2002;60:61-9.
12. Quarto R, Mastrogiacomo M, Cancedda R et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells. N Engl J Med 2001; 344:385-6.
13. Adachi N, Sato K, Usas A et al. Muscle derived, cell based ex vivo gene therapy for treatment of full thickness articular cartilage defects. J Rheumatol 2002;29:1920-30.
14. Assmus B, Schachinger V, Teupe C et al. Transplantation of progenitor cells and regeneration enhancement in acute myocardial infarction - (TOPCARE-AMI). Circulation 2002;106:3009-17.
15. Strauer BE, Brehm M, Zeus T et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans. Circulation 2002;106:1913-8.
16. Tse HF, Kwong YL, Chan JKF et al. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation. Lancet 2003;361:47-9.
17. Menasche P, Hagege AA, Scorsin M et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet 2001;357:279-80.
18. Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet 2002;360:427-35.
19. Zhang ZG, Zhang L, Jiang Q et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells participate in cerebral neovascularization after focal cerebral ischemia in the adult mouse. Circ Res 2002;90:284-8.
20. Badiavas EV, Falanga V. Treatment of chronic wounds with bone marrow-derived cells. Arch Dermatol 2003;139:510-6.
21. Lee K, Majumdar MK, Buyaner D et al. Human mesenchymal stem cells maintain transgene expression during expansion and differentiation. Mol Ther 2001;3:857-66.
22. Gordon EM, Skotzko M, Kundu RK et al. Capture and expansion of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells with a transforming growth factor-beta1-von Willebrand's factor fusion protein for retrovirus-mediated delivery of coagulation factor IX. Hum Gene Ther 1997;8:1385-94.
23. Devine SM, Cobbs C, Jennings M et al. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates. Blood 2003;101:2999-3001.
24. Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med 1999;5:309-13.
25. Domenech J, Roingeard F, Herault O et al. Changes in the functional capacity of marrow stromal cells after autologous bone marrow transplantation. Leuk Lymphoma 1998;29:533-46.
26. Angelopoulou M, Novelli E, Grove JE et al. Cotransplantation of human mesenchymal stem cells enhances human myelopoiesis and megakaryocytopoiesis in NOD/SCID mice. Exp Hematol 2003;31:413-20.
27. Koc ON, Gerson SL, Cooper BW et al. Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy. J Clin Oncol 2000;18:307-16.
28. Kveiborg M, Kassem M, Langdahl B et al. Telomere shortening during aging of human osteoblasts in vitro and leukocytes in vivo: lack of excessive telomere loss in osteoporotic patients. Mech Ageing Dev 1999;106:261-71.
29. Simonsen JL, Rosada C, Serakinci N et al. Telomerase expression extends the proliferative life-span and maintains the osteogenic potential of human bone marrow stromal cells. Nat Biotechnol 2002;20:592-6.