Moderne mikrobiologisk diagnostik

Klinisk mikrobiologi har i Danmark været et lægeligt speciale siden 1966 [1, 2], og specialets kompetenceområder omfatter både laboratoriediagnostik, klinisk rådgivning, infektionshygiejne og overvågning af infektioner og antibiotikaresistens.

Danmark har i et globalt perspektiv haft lav forekomst af antibiotikaresistens. Dette skyldes i høj grad et tæt samarbejde mellem kliniske mikrobiologer og kliniske kolleger om målrettet brug af – så vidt muligt – smalspektrede antibiotika og opmærksomhed på behandlingsindikation. Derudover er der et vedvarende fokus på infektionshygiejne, hvor målrettede indsatser medvirker til at begrænse infektionsforekomst og antibiotikaforbrug og samtidig reducerer transmission af multiresistente bakterier. En særlig styrke ved specialet er, at mikrobiologiske fund fortolkes i relation til den enkelte patients kliniske tilstand, hvilket muliggør individualiseret rådgivning om antibiotisk behandling (Figur 1). Klinisk mikrobiologi har således været et eksempel på »personlig medicin«, længe før begrebet blev etableret i medicinsk praksis.

Formålet med denne artikel er at give eksempler på moderne mikrobiologisk diagnostik med fokus på bakteriologien, herunder bloddyrkninger, hvor metoder med kortere svartider supplerer de klassiske teknikker. Samtidig understreger artiklen, at den tætte kontakt mellem klinikere og laboratorium er vigtigere end nogensinde.

Klassisk mikrobiologisk diagnostik er fortsat relevant og i udvikling

Bakteriologien har traditionelt været domineret af de dyrkningsbaserede metoder, som fortsat er væsentlige i den daglige diagnostik. Dyrkning har høj sensitivitet, da blot en enkelt levedygtig mikroorganisme kan detekteres, og med et fremdyrket isolat kan der udføres resistensbestemmelse og andre sekundære undersøgelser. Klassiske metoder til identifikation af bakterier omfatter mikroskopi (herunder gramfarvning og bevægelighed), kolonimorfologi, fænotypiske egenskaber (f.eks. sælige vækstbetingelser) og biokemiske tests (bl.a. forgæringsrækker).

Resistensbestemmelse udføres primært med diskdiffusionsmetoden – hvor hæmningszonen af bakterievæksten omkring en antibiotikadisk måles efter 16-20 timers inkubering, men hurtigaflæsning (efter 4-8 t.) er under afprøvning [3]. Indførelsen af EUCAST-breakpoints [4] sikrer en ensartet udførelse og fortolkning af antibiotikaresistens, hvilket øger sammenligneligheden på tværs af laboratorier og regioner. Derudover understøtter EUCASTs sygdomsspecifikke breakpoints, at resistensvurderingen – og dermed behandlingen – tilpasses den enkelte infektionstype. I udvalgte tilfælde suppleres med minimal inhibitory concentration (MIC)-bestemmelse, antigen påvisning (f.eks. CPO ved hjælp af lateral flowtest) eller molekylærbiologisk påvisning af resistensgener.

Moderne hurtig diagnostik

Behov for hurtigere svar har drevet udviklingen af teknologier, der supplerer den klassiske diagnostik og muliggør identifikation af mikroorganismer (ID) og resistens [3] inden for få timer i stedet for dage. Nedenfor gennemgås de vigtigste af disse metoder, og i Tabel 1 opsummeres væsentlige forskelle.

Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight-massespektrometri

Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight-massespektrometri, oftest kendt som MALDI-TOF, har haft afgørende betydning i forhold til hurtigere identifikation af bakterier og svampe. Proteiner fra kolonimateriale indlejres i matrix og beskydes med laser, de ioniserede proteiner accelereres igennem et elektrisk spændingsfelt i et vakuumrør og separeres efter masse. Resultatet er et massespektrum, som er så karakteristisk, at det ret præcist kan matches mod omfattende databaser for artsidentifikation.

Metoden er præcis, omkostningseffektiv og giver oftest svar på få minutter. Den kan anvendes på fremdyrkede mikroorganismer og direkte på materiale fra positive bloddyrkningsflasker (efter forbehandling). Metoden har derfor stor betydning ved bakteriæmi, hvor hurtig ID gør det muligt at afkorte tid til optimering af empirisk antibiotikabehandling med 1-2 døgn, baseret på kendskab om medfødt resistens. Derudover giver hurtig arts-ID også vigtig information til målrettet fokusudredning (se eksempel i Tabel 2).

Begrænsninger er især, at metoden sjældent kan anvendes direkte på primærmateriale, kan have vanskeligheder ved blandingskulturer, lav bakteriemængde og ikke kan adskille visse nært beslægtede arter [5]. Der er tiltagende evidens for, at selve spektrene også kan anvendes til at prædiktere resistens [6, 7].

Molekylærbiologiske metoder

I løbet af de seneste 30 år er en række molekylærbiologiske metoder blevet en fast del af den kliniske diagnostik. Den mest udbredte metode er PCR-undersøgelse, hvor man med høj sensitivitet og specificitet kan påvise specifikke DNA- eller RNA-sekvenser fra en mikroorganisme. Dette har haft stor betydning, også i virologien, hvor man nu kan stille en hurtig og præcis diagnose for en lang række virusinfektioner, der tidligere hvilede alene på kliniske fund eller på antistofmålinger sent i forløbet.

De første PCR-analyser var typisk udviklet i det enkelte laboratorie (såkaldt in-house PCR), f.eks. påvisning af varicella-zoster-virus ved encefalitis og Legionella pneumophila ved atypisk pneumoni. Nu findes kommercielle analyser, herunder point-of-care tests (POCT), der er molekylærbiologiske tests med svartid på minutter til timer [8]. Disse kan udføres både tæt på patienten – f.eks. i akutmodtagelsen, fødegangen eller i almenpraksis – og på klinisk mikrobiologisk afdeling [9]. POCT anvendes bl.a. til påvisning af resistens- og virulensgener (f.eks. mecA ved meticillinresistent Staphylococcus aureus) samt til identifikation af f.eks. influenzavirus, SARS-CoV-2 eller gruppe B-streptokokker, hvor man hurtigt skal træffe kliniske beslutninger om behandling, isolation eller videre udredning.

Særligt de seneste 5-10 år er der indført såkaldte syndromiske PCR-paneler, der anvender multiplex real-time PCR til samtidig påvisning af nukleinsyre fra mange patogener i én prøve med en svartid på ca. 1-2 t. [10]. Der findes paneler til sepsis, meningitis/encefalitis, luftvejsinfektion, gastroenteritis og purulent artritis, og markedet er i hastig vækst. Der er dog betydelige udfordringer og overvejelser med implementering i rutinediagnostik: høj pris, begrænsninger i valgte targets (man finder kun, hvad man leder efter) og risiko for påvisning af patogener, der ikke har klinisk relevans [10].

En anden metode, next generation sequencing (NGS), undersøger det DNA, der er til stede i en prøve, og muliggør helgenomsekventering eller målrettet gensekventering. Derved kan bakterier, svampe og parasitter identificeres, og resistens- og virulensgener påvises. Metoderne er særligt nyttige til ikkedyrkbare eller antibiotikahæmmede mikroorganismer og vævsprøver med polymikrobiel flora. Følsomheden ved direkte NGS-undersøgelse af blod regnes for at være lavere end ved bloddyrkning, da et mindre blodvolumen analyseres (0,5 ml vs. 20-40 ml).

NGS anvendes på flere klinisk mikrobiologiske afdelinger og i referencelaboratorierne, men er endnu for tidskrævende og kostbar til bred rutinebrug. Udviklingen går dog hurtigt, og udbredelsen forventes at stige.

Automatisering af det klinisk mikrobiologiske laboratorium

Store dele af det mikrobiologiske laboratoriearbejde er automatiseret med fuldt digitaliserede instrumenter, der kommunikerer direkte med laboratoriesystemet. Inden for dyrkning udsås mange prøver nu med robotter, og flere klinisk mikrobiologiske afdelinger anvender systemer, der både kan inkubere og fotografere agarplader samt – med bioanalytikerassistance – tolke vækst og resistens. F.eks. kan nogle instrumenter adskille urinprøver med og uden vækst, så de kan kasseres direkte uden at skulle aflæses manuelt. Et andet eksempel er bloddyrkningssystemerne, der automatisk detekterer vækst (med angivelse af »time-to-detection«), og muliggør, at kun de positive flasker skal håndteres manuelt.

Også serologiske analyser udføres i dag på automatiserede instrumenter. Mange analyser kan udføres på samme blodprøve, og resultaterne tolkes automatisk.

Molekylærdiagnostik har ligeledes gennemgået en udvikling fra tidskrævende manuelle PCR-processer til fuldautomatiserede arbejdsgange.

Antimicrobial stewardship – en kerneopgave for mikrobiologer

Antimicrobial stewardship er en organiseret tværfaglig indsats, der skal sikre rationel anvendelse af antimikrobielle midler med henblik på at optimere patientbehandlingen og begrænse resistensudvikling. Rationel brug indebærer korrekt indikation, korrekt dosis, optimal varighed og valg af smalspektrede antibiotika.

Danmark har en mangeårig stærk tradition for antimicrobial stewardship-programmer, der historisk har været forankret i det klinisk mikrobiologiske speciale. Specialet har en central rolle i udarbejdelsen af behandlingsvejledninger samt i overvågningen af antibiotikaforbrug og -resistens, både lokalt og nationalt, f.eks. gennem DANMAP-samarbejdet.

Da antimikrobiel behandling iværksættes af mange forskellige læger, er succesfulde programmer afhængige af et tæt tværfagligt samarbejde mellem klinikere og kliniske mikrobiologer. I dag er antimicrobial stewardship en integreret del af hele behandlingsforløbet – fra valg af empirisk antibiotikabehandling til målrettet behandling efter mikrobiologiske fund og klinisk diagnose.

Kliniske implikationer og samarbejde

Udviklingen af moderne hurtig diagnostik giver væsentlige fordele. En hurtigere diagnose muliggør tidligere målrettet behandling og fremmer rationel brug af antimikrobielle midler, dvs. reducerer behovet for bredspektret behandling. De nye teknologier medfører dog også udfordringer. Molekylærdiagnostiske svar kan være komplekse og kræve specialistviden for korrekt tolkning. Her er diagnostic stewardship centralt: at sikre, at de rette undersøgelser bestilles på det rette tidspunkt, og at der følges op på resultaterne på en hensigtsmæssig måde.

Et tæt tværfagligt samarbejde mellem klinikere og kliniske mikrobiologer er afgørende for at udvikle optimale diagnostiske strategier. Mikrobiologer er involveret i alle patientforløb med positive bloddyrkninger og har mange daglige konsultationer med læger fra alle lægelige specialer, hvor der rådgives om tolkning af prøveresultater, antibiotisk behandling og udredning af fokus. Herved sikres et solidt fagligt grundlag for beslutninger, hvilket både understøtter målrettet behandling og bidrager til at reducere resistensudvikling samt unødvendigt brug af diagnostiske tests. Antimicrobial stewardship er således ikke blot en laboratorieopgave, men en integreret patientnær indsats, der kræver samarbejde på tværs i hele forløbet.

Den Danske Mikrobiologidatabase (MiBa) modtager alle mikrobiologiske svar digitalt i realtid på tværs af landet og sikrer adgang til svar for sundhedspersonale og borgere. Ved kobling med nationale registre, såsom Landspatientregistreret, skabes et unikt grundlag for overvågning og monitorering af smitteudbredelse og resistens. MiBAlert er en alert i de elektroniske patientjournalsystemer baseret på data i MiBa. MiBAlert adviserer det kliniske personale om isolationskrævende mikroorganismer hos en patient og styrker dermed infektionskontrol og patientsikkerhed. Samtidig giver MiBa et solidt afsæt for populationsbaserede forskningsstudier, der kan forbedre håndteringen af nye infektionsudfordringer og målrette indsatsen mod infektioners risiko og prognose.

Konklusion og perspektiver

Denne artikel har belyst udviklingen inden for mikrobiologisk diagnostik med fokus på bakteriologien. I takt med at patientforløb og prøvesvar bliver mere komplekse, og nye teknologier som kunstig intelligens og large language models i stigende grad anvendes til tolkning af symptomer og prøvesvar, bliver et endnu tættere samarbejde mellem klinikere og kliniske mikrobiologer essentielt. Målet er sammen at udnytte de moderne metoders potentialer: hurtigere og mere præcise diagnoser, som gavner patienterne, samtidig med at vi sikrer en fornuftig brug af ressourcer og faglig ekspertise ved fortolkning af prøvesvarene. Mens klinikerens fokus er selve patienthåndteringen, bidrager mikrobiologen aktivt ved at vælge de metoder, der giver diagnostiske svar tilpasset den kliniske kontekst, optimerer behandlingen for den enkelte patient og samtidig tager hensyn til generel risiko for resistensudvikling [11].