Molekylære forandringer af troponin I og T påvist i serum hos patienter med akut myokardieinfarkt

Introduktion: De kardiale molekyler troponin I og T (cTnI og cTnT) er højspecifikke serummarkører for påvisning af akut myokardieskade, herunder akut myokardieinfarkt. Imidlertid er de gængse cTnI-målemetoder behæftet med betydelige problemer, og uoverenstemmelser med >20 gange forskel i de kvantitative målinger er blevet påpeget. Disse uoverensstemmelser kunne skyldes frigivelse af forskellige TnI-forandringsprodukter, som er påvist i det iskæmiske myocardium. For at man kan forklare de nævnte uoverensstemmelser, er en kortlægning af de præcise former af troponin, der findes i blodbanen hos patienter med myokardieskader, påkrævet.

Materiale og metoder: Vi har udviklet en Western blot-baseret protokol, der er velegnet til direkte analyse af serum. Herved kan vi påvise både intakt TnI og et spektrum af op til 11 modificerede produkter i patientserum efter AMI.

Resultater: Vi beskriver her både et mønster af tiltagende cTnI-degraderinger og forekomst af fosforyleret cTnI i serum. Antallet og sværhedsgraden af de molekylære forandringer går i deres tidsforløb parallelt med forekomsten af rutineserummarkører såsom kreatinkinase, kreatinkinase-MB og cTnI (målt ved standard ELISA). Gennem in vitro-eksperimenter søgte vi at belyse humant serums bidrag til nedbrydning af troponin I og T: human rekombinant cTnI og cTnT inkuberet med serum viser kun begrænset degradering, hvilket er foreneligt med, at nogle af de påviste former i serum udgår fra myokardiet.

Diskussion: Med dette pilotstudie vises det for første gang, hvilke molekylære troponinstrukturer der optræder i blodbanen hos patienter med AMI. Dette kan forklare manglen på standardiseringen imellem de forskellige diagnostiske troponintest.

Det er i dag accepteret, at påvisning af kardial troponin I eller T (cTnI, cTnT) i blodserum indikerer myokardieskade, og cTnI og cTnT anses således for at være højspecifikke og i øvrigt ligeværdige markører for akut myokardieinfarkt (AMI) (1-3). Selv om troponinmålinger bliver brugt i vidt omfang som diagnostisk værktøj for bl.a. akut koronarsyndrom, er der fortsat betydelige problemer, specielt hvad angår variation i sensitivitet, selektivitet og specificitet af de forskellige kommercielt tilgængelige diagnostiske cTnI-immunotest (4-7). Disse forskelle er begrundet i: 1) mangel på massestandardisering (8-10), 2) formodet forekomst af posttranslatorisk forandret cTnI i serum og 3) variationer i antistoffernes krydsreaktivitet mod de forskellige påviselige cTnI-former (10, 11). Selv om cTnT-måling postuleres at være uden disse problemer, er dette punkt ikke påvist endnu, idet der indtil nu kun findes en enkel kommerciel tilgængelig diagnostisk cTnT-test. Det tilgrundliggende problem er uvidenhed om, hvilke eksakte former og mængder af cTnI og cTnT der forekommer i blodet hos patienterne.

På baggrund af tidligere studier har man postuleret, at kun små mængder af fri intakt cTnI forekommer i blod, og at den primære form er et kompleks mellem cTnI og troponin C (11-13). Vi har imidlertid påvist forskellige forandringer, herunder degradering, kovalent kompleksdannelse og fosforylering af cTnI i iskæmisk rottemyocardium (14-16) og postiskæmisk myocardium hos mennesker (17, 18). Det er disse forandrede produkter, og ikke intakt cTnI, der kan påvises i effluatet fra iskæmiske rottehjerter (15). Lignende overvejelser gør sig gældende for cTnT, der er en ligeværdig biokemisk markør for myokardieiskæmi (19). Betydningen af forekomsten af disse modificerede troponinprodukter (fragmenter) er imidlertid aldrig blevet undersøgt, skønt de kunne have klinisk betydning som korrelat til fx sygdomsprogression.

I det foreliggende pilotstudie har vi karakteriseret modifikationsprodukterne af cTnI og cTnT i blod fra patienter med AMI ved hjælp af en Western-blot-analyse af serum.

Metoder
Patientprøver

Blodprøver fra 12 patienter med nyopståede brystsmerter og utvetydige tegn på AMI i ekg'et blev taget i forbindelse med de sædvanlige målinger af koronarenzymer og var godkendt af den lokale etiske komite. Idet man fulgte de individuelle ordinationer med hensyn til blodprøvetagningen, fik man forskellige tidsintervaller mellem blodprøverne hos de forskellige patienter. Dette var i fuld overensstemmelse med pilotstudiets formål, nemlig at undersøge forekomsten af de forskellige markører i forskellige tidsmæssige perspektiver.

Rutinebiokemiske test

Blodet blev opsamlet i sædvanlige blodprøveglas, centrifugeret og umiddelbart sendt til rutinebiokemiske test. Disse inkluderede total kreatinkinase, CK-MB (kreatin-kinases MB-fraktion) og cTnI (Technicon Immuno-1 test, Bayer). AMI-diagnosen blev stillet på baggrund af en forhøjelse af CK og CK-MB eller cTnI, hvis CK-MB-forhøjelsen var > 8 μg/l eller > 3% af total CK, eller hvis cTnI var > 0,9 μg/l.

Stabilitetsstudier for cTnI og cTnT

For at vurdere serums bidrag til cTnI- og cTnT-nedbrydning inkuberede vi human rekombinant cTnI (fuldlængde: 209 aminosyrer 1-209), rekombinant cTnI-fragment (aminosyre 1-192, rcTnI1-192 ) og rekombinant cTnT i tre forskellige serumpuljer (koncentration 100 μ g/l, 37 ºC, 48 timer) fra normale forsøgspersoner uden hjertesygdom.

Elektroforese og Western blot-analyse

Polyacrylamid-gel-elektroforese blev udført med prøvebuffer, der indeholdt 0,33 % SDS (natrium dodecylsulfat), 0,33 % CHAPS ([3-cholamidopropyl-dimethylammonio]-1-propansulfonat), 0,33% NP-40 (NONIDET P-40), 0,1 mol/l DTT (DL-dithiothreitol), 4 mol/l urea, og 50 mmol/l Tris-Cl (Trizma hydrochlorid [Tris(hydroxymathyl)aminomethanhydrochlorid]) (pH 6,8) i 50% glycerol. Serum blev fortyndet 12,5 gange i prøvebufferen og kogt i 10 min. 25 μl af prøven (svarende til 2 μl af det oprindelige serum) blev overført til 12% gel (14 × 14 cm, 0,75 mm's tykkelse) og separeret under 110 V spænding i fem timer. Proteinerne på gelen blev herefter overført til nitrocellulose (45 mM) med 10 mmol/l CAPS (pH 11,0) under 100 V spænding i en time ved 4 ºC, og membranerne blev blokeret ved hjælp af blokeringsbuffer i 12 timer ved 4 ºC.

Immunoblotanalyse blev udført med følgende anti-cTnI-antistoffer (abs.) (rettet mod epitoperne imellem følgende aminosyrer [AA]): monoklonal abs. 8I-7 (AA 136-156, konc. 0,5 μ g/ml), monoklonal abs. 3E3 (AA 1-54, konc. 0,5 μ g/ml); polyklonal abs. P1 (AA 1-26, konc. 0,5 μ g/ml); monoklonal abs. 10F2 (AA 188-192, konc. 0,25 μ g/ml) og polyklonal anti-cTnT (AA 1-15, konc. 0,5 μ g/ml). De primære antistoffer blev påvist ved peroxidase-konjugeret ged-anti-mus- eller kanin-anti-ged-IgG og synliggjort ved kemiluminescenssubstrat.

Defosforylering af serum

I alt 100 U af alkalisk fosfatase (New England Biolabs) og 1,6 μ l af ti gange defosforyleringsbuffer (50 mmol/l Tris, 100 mmol/l NaCl, 10 mmol/l MgCl2 , og 1 mmol/l DTT, pH 7,9) blev tilsat 4 μl serum (ca. 100 mg/ml serumproteiner) og inkuberet i 30 min ved 30ºC (20, 21). Reaktiviteten blev afbrudt ved tilføjelse af 4 μl a fem gange prøvebuffer og kogning i 5 min.

Resultater

Fig. 1 viser Western blots for fem repræsentative AMI-patienter. Ud over intakt cTnI ses otte trunkerede degraderingsprodukter (fragmenter) og tre produkter med højere molekylærvægt end TnI. Antallet og graden af cTnI-forandringerne hos hver enkelt patient ændrede sig over tid efter infarktet. Denne profil af de synlige cTnI-fragmenter (og deres intensitet på immunoblottet) korrelerede med tidsprofilerne af serum CK, CK-MB, og cTnI målt med kommercielle test.

TnT-Western blot-analyse af blodprøven fra patient nr. 1 viste omfattende degradering af intakt cTnT til et enkelt trunkeret produkt af molekylærvægt 26 kDa (Fig. 1A). Derudover optrådte yderligere to produkter i prøven. Ligesom cTnI skifter mængden af det påviselige cTnT over tid efter infarktet. Denne profil korrelerede også med tidsprofilerne af CK, CK-MB, og cTnI. Det er interessant, at cTnI blev påvist tidligere (»tidligere positiv«) end cTnT hos denne enkelte patient med AMI.

Defosforylering af serum bekræftede, at en del af cTnI (både det intakte og fragmenterne) var fosforyleret. Nogle af antistofferne (Fig. 2B , C og D ) ændrede deres immunoreaktivitet mod cTnI på grund af defosforyleringen af serum (Fig. 2A ). Der har ikke tidligere været vist fosforylering af cTnI i blod fra patienter med AMI.

Alle cTnI-fragmenter opstod på grund af C-terminale trunkeringer, der var påvist ved manglende immunoreaktivitet mod det C-terminale anti-cTnI-antistof 10F2 (Fig. 2D). Derudover opstod degraderingsprodukter under 22 kDa's vægt på grund af både N- og C-terminale afspaltninger, som påvist ved manglende interaktion med det N-terminale anti-cTnI-antistof P1 (Fig. 2A).

Et af de uafklarede spørgsmål var, om proteinforandringerne, der var påvist i serum, opstod før eller efter frigivelse fra myokardiet. Vi søgte at belyse dette ved at tilsætte human rekombinant cTnI (rcTnI), rcTnI 1-192 , eller rcTnT til normalserum, efterfulgt af en inkubering ved 37ºC i 48 timer (data ikke vist). Ved en Western blot-analyse sås der degradering af cTnI i serum inden for 30 min, hvilket resulterede i et fragment, som migrerede på gelen til samme position som rcTnI1-192 . Derudover fandtes der ingen yderligere fragmenter. Degradering af rcTnI 1-192 opstod i mindre grad end ved intakt cTnI. Humant rcTnT var ikke underlagt nogen form for degradering i normalserum. Optøning/nedfrysning af både normalserum og serum taget efter AMI (begge indeholdende rcTnI og rcTnT) viste ingen ændring af degraderingsmønstret i vores Western blot-analyse.

Diskussion

Det fulde diagnostiske potentiale af cTnI er til dato begrænset af store forskelle i målingerne mellem de kommercielt tilgængelige diagnostiske test (8, 22, 23). Vi rapporterer her om en Western blot-baseret serumanalyse, som direkte kan spore cTnI og cTnT i serum fra patienter med diagnosticeret AMI: Ændringerne i cTnI-profilen efter AMI kan betragtes som et kontinuum, der indeholder specifikke nedbrydningsprodukter, som ikke optræder, når man undersøger rekombinant cTnI og dennes proteolytiske tilbøjelighed i normalserum. Der er åbenlyse forskelle i den manglende tilstedeværelse af højmolekylære produkter (dvs. kompleksdannelser) og af spaltningsprodukter under 22 kDa.

Om end rcTnT ikke udviser proteolytisk tendens i normalserum, har AMI-patienter alligevel kun en lille mængde intakt cTnT i blodbanen, hvor hovedparten er et større og to mindre degraderingsprodukter af cTnT. Det er derfor sandsynligt, at disse former af cTnI og cTnT, som kun findes hos AMI-patienter, opstår i og udgår fra det syge myocardium. Faktisk ligner de her beskrevne cTnI-ændringer præcis de tidligere af os rapporterede fragmenter, der er påvist i myokardiet fra dyr (14) og fra patienter under koronar bypassoperation (15, 16, 18). I et studie af myokardiebiopsier fra 42 bypasspatienter fandt vi, at forekomsten af specifikke cTnI-nedbrydningsprodukter korrelerede med graden af myokardieskaden (18). På lignende måde korrelerede de her påviste fragmenter med sværhedsgraden af infarktet bedømt ved forløbet af de rutinemæssigt målte markører CK, CK-BM og cTnI (Fig. 1).

Selv om rekombinant cTnI forbliver relativt stabil i serum, var det interessant at notere, at en måling med et kommercielt kit (immuno 1-testen) fejlagtigt viste et betydelig fald af rcTnI over en 48-timers-periode (data ikke vist). Fundet afspejler den kendsgerning, at nøjagtigheden af denne diagnostiske test falder med tiden efter det iskæmiske insult. Dette øger risikoen for falsk negative resultater hos patienter med mindre myokardieskade og/eller sen henvendelse til skadestuen.

En forklaring på den ændrede nøjagtighed kunne ligge i en uformåen for de kommercielt brugte antistoffer til at genkende de påviste former af ændret troponin, frem for den faktiske serumkoncentration af cTnI. Hvis dette er tilfældet, skulle man advokere for at nedsætte detektionsgrænsen for dermed at øge sensitiviteten af de diagnostiske test. Dette skulle være praktisk gennemførligt ved at optimere antistof-kombinationen med henblik på at påvise alle de forskellige fragmenter af cTnI. Dette koncept er understøttet af data fra ovennævnte studie med bypasspatienter (18), hvor cTnI allerede var påviselig ved Western blot, men stadig var negativ i immuno 1-testen. Det er i denne sammenhæng tankevækkende, at det nyligt gennemførte FRISC-II-studie af patienter med ustabilt koronarsyndrom har vist, at en nedsættelse af skæringsværdien for troponin fra 1,0 μg/l til 0,3 μg/l medførte bedre prognostisk værdi af denne test (24).

Ved sammenligning af tidsforløbet i Western blot-analysen (Fig. 1) med resultaterne af antistofferne, der genkender forskellige epitoper af cTnI (Fig. 2), kan man bekræfte, at cTnI, som det findes i serum efter AMI, både er C- og N-terminaltrunkeret (10, 13, 25). Den C-terminale afspaltning sker som det første af mange proteolytiske skridt og resulterer i op til otte degraderingsprodukter, som findes i blodet efter AMI. Vi støtter derfor Katrukha et al (25) i deres forslag om at undgå brug af antistoffer, der er rettet mod ekstremt C- ell er N-terminalt beliggende epitoper på cTnI-molekylet, til diagnose af AMI. Heri ligger netop vanskeligheden med standardiseringen af cTnI-testen. Om det samme gør sig gældende for cTnT, kan ikke bedømmes, fordi der kun er en enkelt kommerciel test på markedet. Firmaet bag denne test har faktisk allerede introduceret opdaterede versioner af cTnT-testen, idet der har været problemer med falsk positive resultater (fx hos nyresyge patienter). Det er meget sandsynligt, at man vil opleve de samme forskelle testene imellem som med cTnI-testene, så snart der kommer andre cTnT-test på markedet.

Som konklusion har vi i dette pilotstudie ved hjælp af Western blot-analyse af serum for første gang kunnet identificere de eksakte molekylære former af cTnI og cTnT, som optræder i blodbanen hos patienter efter myokardieskade. Vi påviser, at de molekylære forandringer af cTnI og cTnT hos patienter med AMI dels opstår allerede intramyokardialt, dels kan tilskrives serums indvirken efter frigivelsen af troponinerne. Antallet og graden af de molekylære forandringer hos den enkelte patient skifter over tid efter infarktet.

Spørgsmålet forbliver, om forekomsten af nogle af troponins fragmenter eller et distinkt mønster af dem korrelerer med en specific kardiovaskulær tilstand, med et specifikt tidspunkt efter et AMI, eller muligvis med infarktets sværhedsgrad eller endda den videre prognose. Disse emner bør belyses ved støre kliniske studier.

Dan Atar , H:S Frederiksberg Hospital, kardiologisk klinik E, DK-2000 Frederiksberg. E-mail: datar@dadlnet.dk

Antaget den 25. juli 2002.

H:S Rigshospitalet, kardiologisk klinik B, og

H:S Frederiksberg Hospital, kardiologisk-endokrinologisk klinik E, og

Queens University, Kingston, Ontario, Canada, Department of Physiology.

This article is based on a study first reported in the Circulation 2000; 102: 1221-6.

Undersøgelsen er støttet af Hjerteforeningen i Danmark (bev.nr. 00-2-3-46-22854 til D.A.), Medical Research Council of Canada (bev.nr. 14375 til J.V.E.) og Heart Foundation of Canada (bev.nr. 3759 til J.V.E.).

1. Chapelle JP. Cardiac troponin I and troponin T: recent players in the field of myocardial markers. Clin Chem Lab Med 1999; 37: 11-20.
2. Wu AHB. A comparison of cardiac troponin T and cardiac troponin I in patients with acute coronary syndromes. Coronary Artery Dis 1999; 10: 69-74.
3. Antman EM, Tanasijevic MJ, Thompson B, Schactman M, McCabe CH, Cannon CP et al. Cardiac specific troponin I levels to predict the risk of mortality in patients with acute coronary syndromes. N Engl J Med 1996; 335: 1342-9.
4. Katus HA, Remppis A, Neumann FJ, Scheffold T, Diederich KW, Vinar G et al. Diagnostic efficiency of troponin T measurements in acute myocardial infarction. Circulation 1991; 83: 902-12.
5. Hamm CW, Ravkilde J, Gerhardt W, Jorgensen P, Peheim E, Ljungdahl L et al. The prognostic value of serum troponin T in unstable angina. N Engl J Med 1992; 327: 146-50.
6. Stromme JH, Johansen O, Brekke M, Seljeflot I, Arnesen H. Markers of myocardial injury in blood following PTCA: a comparison of CKMB, cardiospecific troponin T and troponin. Scand J Clin Lab Invest 1998; 58: 693-9.
7. Katrukha A, Bereznikova A, Pettersson K. New approach to standardisation of human cardiac troponin I (cTnI). Scand J Clin Lab Invest 1999; 230: 124-7.
8. Tate JR, Heathcote D, Rayfield J, Hickman PE. The lack of standardization of cardiac tropanin I assay systems. Clin Chim Acta 1999; 284: 141-9.
9. Newman DJ, Olabiran Y, Bedzyk WD, Chance S, Gorman EG, Price CP. Impact of antibody specificity and calibration material on the measure of agreement between methods for cardiac troponin I. Clin Chem 1999; 45: 822-8.
10. Shi Q, Ling M, Zhang X, Zhang M, Kadijevic L, Liu S et al. Degradation of cardiac troponin I in serum complicates comparisons of cardiac troponin I assays. Clin Chem 1999; 45: 1018-25.
11. Wu AH, Feng YJ, Moore R, Apple FS, McPherson PH, Buechler KF et al. Characterization of cardiac troponin subunit release into serum after acute myocardial infarction and comparison of assays for troponin T and I. American Association for Clinical Chemistry Subcommittee on cTnI Standardization. Clin Chem 1998; 44: 1198-208.
12. Giuliani I, Bertinchant JP, Granier C, Laprade M, Chocron S, Toubin G et al. Determination of cardiac troponin I forms in the blood of patients with acute myocardial infarction and patients receiving crystalloid or cold blood cardioplegia. Clin Chem 1999; 45: 213-22.
13. Morjana NA. Degradation of human cardiac troponin I after myocardial infarction. Biotechnol Appl Biochem 1998; 28: 105-11.
14. Gao WD, Atar D, Liu Y, Perez NG, Murphy AM, Marban E. Role of troponin I proteolysis in the pathogenesis of myocardial stunning. Circ Res 1997; 80: 393-9.
15. McDonough JL, Arrel DK, Van Eyk JE. Torponin I degradation and covalent complex formation accompanies myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Res 1999; 84: 9-20.
16. Van Eyk JE, Powers F, Law W, Larue C, Hodges RS, Solaro RJ. Breakdown and release of myofilament proteins during ischemia and ischemia/reperfusion in rat hearts: identification of degradation products and effects on the pCa-force relation. Circ Res 1998; 82: 261-71.
17. Murphy AM, Kogler H, Georgakopoulos D, McDonough JL, Kass DA, Van Eyk JE et al. Transgenic mouse model of stunned myocardium. Science 2000; 287: 488-91.
18. McDonough JL, Labugger R, Pickett W, Tse MY, MacKenzie S, Pang SC et al. Cardiac troponin I is modified in the myocardium of bypass patients. Circulation 2001; 103: 58-64.
19. Apple FS. Tissue specificity of cardiac troponin I, cardiac troponin T and craetine kinase-MB. Clin Chim Acta 1999; 284: 151-9.
20. Swarup G, Cohen S, Garbers DL. Sel