Mutationer i epidermal vækstfaktor-receptoren: struktur og tumorbiologisk relevans

Epidermal vækstfaktorreceptoren (EGFR) spiller en vigtig rolle i reguleringen af normal celledeling, -differentiering og -overlevelse. EGFR-status ses som følge deraf tit at være ændret i en række tumorer af forskellig oprindelse. Disse ændringer korrelerer generelt med en dårlig prognose. I de seneste år er der fundet en lang række mutationer i EGFR-genet, som giver ophav til overaktive eller konstant aktive receptorer, der medvirker i tumorgenesen. Denne oversigtsartikel giver et overblik over disse mutationer, deres biologiske funktion i tumorer hos mennesker og potentialet i behandlingen af disse tumorer.

Den epidermale vækstfaktor-receptor (eller EGFR, ERBB1, HER1) spiller en vigtig rolle i reguleringen af cellulære processer såsom celledeling, -differentiering og -overlevelse. EGFR er en central faktor i vedligeholdelsen af normale epiteliale væv, hvor dens aktivitet er nøje reguleret.

En ubalance i denne regulering er en medvirkende årsag til dannelsen og specielt udviklingen af en række tumorer. Disse inkluderer tumorer med oprindelse fra lungerne, brystet, prostata, tyktarmen, ovarierne, hjernen og tumorer i hoved-hals-området [1].

Selv om sammenhængen mellem EGFR-status og prognose ikke er forstået til fulde, er EGFR-overudtryk i tumorer ofte associeret med mere aggressiv sygdom, øget resistens mod kemoterapi såvel som radioterapi, dannelse af metastaser og nedsat overlevelse [1, 2]. I de senere år er det blevet klart, at EGFR-genet ofte er muteret i tumorer hos mennesker, og at disse mutationer kan have stor betydning for diagnose, prognose og behandling.

Denne oversigtsartikel vil forsøge at give et overblik over disse mutationer og deres biologiske funktion i tumorer hos mennesker.

Materiale og metoder

Litteraturgennemgangen er baseret på søgninger i oktober 2005 i PubMed ved brug af følgende ord: EGFR, mutations, EGFRvIII, glioblastoma, NSCLC, gefitinib og prognosis . Derudover er gennemgangen baseret på tidligere søgninger [3] og [4] samt på litteratur fundet ved gennemgang af referencelister i de fundne artikler. I gennemgangen er kun engelsksprogede artikler blevet benyttet.

Den epidermale vækstfaktor-receptor

EGFR tilhører erythroblastosis B (ERBB)-familien af receptortyrosinkinaser, der ud over EGFR omfatter ERBB2 (HER2), ERBB3 (HER3) og ERBB4 (HER4) [5]. EGFR kodes af ERBB1 -genet, som består af ca. 190 kilobaser DNA, indeholder 28 exoner og er placeret på kromosomarm 7p11-13 (Figur 1 ) [6]. Et specielt forhold ved EGFR-genet er det meget lange intron 1, der spænder over næsten to tredjedele af genet, og som menes at være involveret i dannelsen af mutationer, som det vil fremgå senere [6].

EGFR er et 170 kDa transmembrant glykoprotein, som består af et ekstracellulært ligandbindende domæne, et transmembrant domæne og et intracellulært domæne, der indeholder tyrosinkinasen (Figur 1B ). Den ekstracellulære del af receptoren kan yderligere deles op i fire underdomæner: I (L1), II(S1), III(L2) og IV(S2), hvoraf II og IV er cysteinrige. Underdomæne I er kodet af exonerne 1-4, underdomæne II af exonerne 5-8, underdomæne III af exonerne 9-11, mens underdomæne IV kodes af exonerne 12-14. Tyrosinkinasedomænet er indeholdt i exonerne 18-24. I krystallografiske studier har man påvist, at underdomænerne I, II og III danner en struktur, der minder om en »lomme«, hvori liganderne binder (Figur 1B) [7].

EGFR binder seks naturlige ligander: EGF, heparinbindende EGF-lignende vækstfaktor (HB-EGF), epiregulin (ER), transformerende vækstfaktor alpha (TGF-α), amphiregulin og betacellulin. Binding af ligand til receptoren medfører dimerisering og efterfølgende autofosforylering af C-terminale aminosyrer [8]. Disse fosforylerede aminosyrer binder signalmolekyler, og EGFR aktiverer derved en række signaltransduktionsveje. Aktivering af disse veje fører bl.a. til ændringer i genudtryk, som igen påvirker cellulære processer som celledeling, apoptose, motilitet, invasion, adhæsion og angiogenese.

Epidermal vækstfaktor og cancer

Det første bevis for, at EGFR er involveret i udviklingen af cancer var opdagelsen af, at EGFR er den mammale pendant til det virale onkogen v-erbb , der inducerer leukæmi (erytroblastose) i kyllinger [9]. Sidenhen har det vist sig, at EGFR-status er ændret i en lang række tumorer med oprindelse fra så forskellige væv som hjerne, hoved-hals-området, tyktarmen, bugspytkirtlen, lungerne, leveren, ovarierne, prostata, nyrerne og brystet [10]. Ud over at være overudtrykt som følge af øget promoteraktivitet eller amplifikation (dannelse af multiple kopier) af EGFR -genet, kan en række mekanismer føre til ændret EGFR-status. Blandt de mest hyppige kan nævnes aktiverende mutationer, autokrin produktion af ligander og aktivering via andre receptorsystemer [11].

Epidermal vækstfaktor-mutationer

I mange tilfælde er amplifikation af EGFR -genet sammenfaldende med somatiske mutationer (eller abnorme splejsvarianter). Nye resultater viser, at strukturelle ændringer i EGFR-genet er mindst lige så vigtige som generelt overudtryk, når det drejer sig om onkogen effekt på celler [12]. Desuden har det vist sig, at sådanne ændringer korrelerer med en dårligere prognose [13, 14]. Mutationer i EGFR -genet kan deles op i tre hovedgrupper: dem, der fører til ændringer i strukturen af den ekstracellulære del af receptoren, dem, der fører til ændringer i det intracellulære domæne, og dem, der specifikt fører til ændringer i det aktive site i tyrosinkinasen (Tabel 1 ).

Mutationer i det ekstracellulære domæne

Mutationer i det ekstracellulære domæne er især hyppige i glioblastomer og mere end fem forskellige mutationer er beskrevet (Figur 1B, Tabel 1). De fleste muterede receptorer har deletioner af specifikke exoner, der koder for hele eller dele af det ekstracellulære domæne. Dette resulterer i afkortede (trunkerede) receptorer, der kan fremme tumordannelse ved at være konstant aktive, have nedsat receptornedregulering, aktivere alternative signalveje eller afkoble apoptotiske mekanismer [15-18]. De molekylære mekanismer bag disse ændringer er endnu uklare, men studier af EGFRvIII indikerer, at niveauet af aktivering spiller en rolle (se nedenfor).

EGFR-mutant-receptor 1 eller EGFRvI mangler størstedelen af det ekstracellulære domæne, derved minder denne mutant meget om den virale variant v-Erb, der som tidligere nævnt inducerer leukæmi i kyllinger (Figur 1B, receptor nr. 3 og 4). EGFRvI kan ikke binde ligand, men er trods dette konstant aktiv. EGFRvII har en in-frame -deletion af 83 aminosyrer (exonerne 14-15) uden for det ligandbindende domæne og kan derfor stadig binde ligand (Figur 1B nr. 5) [19]. Funktionen af denne mutant i onkogenesen er ukendt.

Den hyppigst forekommende og bedst karakteriserede EGFR-mutation er EGFRvIII. EGFRvIII er resultatet af en in-frame -deletion af exonerne 2-7, der koder for underdomæne I og to tredjedele af underdomæne II (Figur 1B nr. 6) [20]. Den resulterende trunkerede receptor mangler aminosyrerne 2-273 og dermed det meste af det område, der binder ligander. På trods af denne trunkering dimeriserer EGFRvIII spontant og aktiverer derved sig selv uafhængigt af ligandbinding. Niveauet af denne spontane aktivering er nok til at aktivere en række tumorfremmende signalveje, som også reguleres af EGFR, herunder aktivering af ekstracellulær reguleret kinase (ERK) via RAS og proteinkinase B (PKB eller AKT) via fosfatidylinositol-3-OH-kinase (PI3K). Derudover aktiverer EGFRvIII alternative signalveje, som ikke normalt aktiveres af EGFR. Bl.a. er det vist at EGFRvIII aktiverer c-jun N-terminal kinase (JNK) via PI3K, men funktionen af denne signalvej i onkogenesen er endnu ukendt [21]. I modsætning til EGFR aktiverer EGFRvIII ikke STAT1 og STAT3 og bliver heller ikke ubiquitinyleret, hvilket forhindrer EGFRvIII i at blive effektivt internaliseret og nedbrudt [4, 21-23]. EGFRvIII ser derfor ud til være fanget i en delvis aktiveret konformation, som gør den i stand til at aktivere onkogene signalveje, men ikke til at blive nedreguleret og derved afbryde signalering.

EGFRvIII er fundet overudtrykt i tumorer med oprindelse fra hjernen, brystet, prostata, lungerne, ovarierne og leveren, men især glioblastomer har en høj frekvens (30-60%) af EGFRvIII [24]. Denne brede forekomst indikerer en stærk selektion for EGFRvIII-positive tumorceller in vivo. I et stort antal studier er det nu fastslået, at EGFRvIII spiller en aktiv rolle i dannelsen og udviklingen af tumorer hos mennesker ved bl.a. at øge celledeling, cellemotilitet samt cellers mulighed for at modstå gængse cytostatika [4, 22, 25]. En variant af EGFRvIII-mutationen, der ud over exonerne 2-7 også mangler exons 12-13, er også beskrevet og benævnes EGFRvIII/D12-13 (Figur 1B nr. 7) [26]. Den resulterende receptor mangler i forhold til EGFRvIII et stykke af underdomæne III, men har ellers samme karakteristika.

Tabet af exons 2-7 i både EGFRvIII og EGFRvIII/Δ12-13 fører til en splejsning af exon 1 og exon 8 med dannelsen af et nyt kodon (GGT), og dermed indføjes en ny aminosyre (glycin), der ikke er til stede i EGFR [19]. EGFRvIII og EGFRvIII/Δ12-13 indeholder derfor en ny epitop, som kan bruges til terapeutiske formål, som det vil fremgå senere. EGFRvIII/Δ12-13 indeholder yderligere en ny aminosyre, histidin, i sammenkoblingen mellem exonerne 11 og 14.

Ud over deletioner af specifikke exoner, findes der også en række EGFR-mutanter med duplikationer af specifikke exoner. EGFR.TDM/2-7 har duplikation af exon 2-7, hvilket resulterer i en receptor med et ekstra cysteinrigt underdomæne II og delvis duplikation af underdomæne I (Figur 1B nr. 8) [27]. At exonerne 2-7 også er involveret i duplikationer indikerer, at de molekylære processer, som fører til dannelsen af EGFR-deletioner og -duplikationer, kan være relaterede.

Mutationer i det intracellulære domæne

EGFR-mutationer i det intracellulære domæne er bedst beskrevet i hjernetumorer, og som for mutationerne i det ekstracellulære domæne, drejer det sig om store deletioner og duplikationer af exoner (Tabel 1). EGFRvIV og EGFRvV bærer begge deletioner i den c-terminale del af receptoren. EGFRvIV mangler exonerne 18-25 og dermed hele tyrosinkinasedomænet [27-29]. EGFRvV er trunkeret ved aminosyre 959 og mangler som EGFRvIV hele tyrosinkinasen men også den c-terminale del. Relevansen af disse mutationer formodes at være begrænset pga. manglende kinaseaktivitet.

EGFR.TDM/18-25 og EGFR.TDM/18-26 har duplikationer af henholdsvis exonerne 18-25 og 18-26, som koder for hele tyrosinkinasen (Figur 1B nr. 9). Det er dog uvist, om den ekstra tyrosinkinase fører til øget kinaseaktivitet.

Mutationer i tyrosinkinasedomænet

For nylig er en række små mutationer i tyrosinkinasedomænet beskrevet ved lungecancer (Tabel 1) [30, 31]. Disse mutationer forekommer især i adenokarcinomer fra ikkerygende kvinder med asiatisk baggrund, hvilket er den samme subpopulation, som responderer på EGFR-tyrosinkinasehæmmerne iressa (Gefitinib) og tarceva (Erlotinib) [30, 31]. Af de syv exoner, der koder for tyrosinkinasen (exonerne 18-24), er mutationerne begrænset til de første fire (exons 18-21), der koder for den lille »N-lobe« og dele af »C-lobe« inklusive den aktiverende A-loop (Figur 2A og2B ). Mere end 110 forskellige mutationer er ifølge Cosmic databasen (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/) beskrevet i dette område for ikkesmåcellede lungekarcinomer (NSCLC), fordelt på 573 forskellige prøver. Disse prøver udgjorde 18% af de 3.183 analyserede væv. Fire af disse mutationer udgør mere end 80% (Figur 2A). Disse er små deletioner, der er centreret omkring tre til fire kodoner i exon 19 (koder for aminosyrerne E746-A750), missense -mutationerne L858R i exon 21 og G719A/C i exon 18 samt små duplikationer eller indsætninger i en lille region af exon 20 omkring det kodon, der koder for aminosyren L747 (Figur 2C). En missense -mutation er en mutation, der ændrer en aminosyrekodon til en kodon for en anden aminosyre.

Hvad er den tumorbiologiske relevans af disse mutationer? I en række nye studier er det påvist, at mutationerne øger ligandstimuleret aktivering af receptoren, og at aktiveringen af receptorerne desuden er længerevarende [30, 33]. En øget aktivering af overlevelsessignalveje er også fundet [30, 33].

Umiddelbart har de fire typer af mutationer ikke noget tilfælles, ud over at være lokaliseret omkring ATP og iressa/tarceva bindingsstedet (Figur 2C ). Det har været foreslået, at mutationerne fører til en omstrukturering af kritiske aminosyrer, hvilket medfører en stabilisering af ATP og inhibitorbinding i kløften mellem N-lobe og C-lobe [32]. Hvilket kunne forklare den øgede aktivitet af receptoren og den øgede sensitivitet for inhibitorer.

Hvorda n opstår epidermal vækstfaktor-mutationer?

Alle de beskrevne mutationer på nær de små mutationer i tyrosinkinasedomænet er generelt store deletioner eller duplikationer, der fører til et omstruktureret selvaktiverende gen. Mutationerne opstår de novo i celler, der i forvejen har EGFR-genamplifikation [29]. En analyse af de genomiske omstruktureringer, der finder sted i forbindelse med EGFRvIII-udtryk har vist, at DNA-bruddet altid forekommer omkring en bestemt sekvens, et såkaldt Alu-element, i intron 7 [34]. Alu-elementer er hyppigt forekommende DNA-sekvenser i det humane genom og er kendetegnet ved at de kan skæres af restriktionsenzymet Alu1 [34]. Yderligere er det blevet vist, at det meget store intron 1 indeholder op mod 11 lignende Alu-elementer [34]. Det er derfor nærliggende at tro, at Alu-elementet i intron 7 og et vilkårligt Alu-element i intron 1 er involveret i en rekombination, der fører til dannelsen af exon 2-7 trunkerede gener, der alle giver ophav til EGFRvIII. Alu-elementer i øvrige introner i EGFR-genet kan forklare flere af de andre mutationer. Alu-medieret rekombination, der fører til inaktivering af tumorsupressorgener, er velbeskrevet i litteraturen [35]. EGFRvIII derimod er det første eksempel, hvor Alu-medieret intragen omstrukturering fører til proteinaktivering.

De små mutationer i EGFR-tyrosinkinasen derimod menes at være forårsaget af et på nuværende tidspunkt ukendt karcinogen. Den høje forekomst af denne type mutationer blandt ikkerygende kvinder fra stillehavsområdet har ført til en formodning om, at det kan være røg fra madlavningsolier, der er årsag til disse mutationer [32]. Dette er dog indtil videre udokumenteret.

Epidermal vækstfaktor-mutationer og tumorprognose

EGFR-mutationer er især i hjernetumorer forbundet med en dårlig prognose. For patienter med glioblastomer er tilstedeværelse af EGFR-genamplifikationer og samtidigt udtryk af EGFRvIII den stærkeste indikator for en dårlig prognose, mens EGFRvIII i anaplastiske astrocytomer i sig selv er en prognostisk indikator [14, 36]. Anderledes ser det ud for patienter med NSCLC og tyrosinkinasemutationer. Disse patienter har en øget overlevelse på ca. 18 måneder sammenlignet med tilsvarende patienter uden disse mutationer efter behandling med gefitinib [37].

Targetering af epidermal vækstfaktor-mutationer

Mange EGFR-mutationer fører til ændringer i mRNA og aminosyresekvens og da de samtidig er cancerspecifikke, kan de derfor bruges til at målrette anticancerbehandling. Især EGFRvIII har som den hyppigst forekommende i denne gruppe været genstand for intense undersøgelser. Ved dannelsen af EGFRvIII splejses exon 1 og exon 8 sammen, og i sammenføjningen opstår som tidligere nævnt et nyt kodon, der koder for aminosyren glycin. mRNA-sekvensen omkring splejsjunktion kan bruges til antisensestrategier, der målrettet fjerner EGFRvIII mRNA fra cellen. Dette enten vha små interfererende RNA (siRNA) eller ribozymer [38, 39]. Ribozymer er katalytiske RNA'er, der kan kløve mRNA ved specifikke sekvenser [39]. Begge metoder hæmmer væksten af tumorceller in vitro og in vivo [38, 39].

Sekvensen omkring den unikke aminosyreglycin er blevet brugt til at danne EGFRvIII-specifikke antistoffer [24]. Sådanne antistoffer kan bruges enten alene eller bevæbnet, dvs. koblet til en radioaktiv isotop eller til et celletoksin, til at hæmme væksten af eller dræbe cancerceller (Figur 3 ) [24]. Bevæbnede EGFRvIII-specifikke antistoffer er i klinisk afprøvning mod glioblastomer [24, 40].

Det er også muligt at rejse et humoralt og cellulært immunrespons mod celler, der udtrykker EGFRvIII ved at immunisere direkte med et 14 aminosyre langt peptid indeholdende den unikke aminosyre glycin eller mere effektivt med dendritceller, som præsenterer peptidet for immunsystemet (Figur 3) [40]. Begge strategier er i klinisk fase II-undersøgelser hos patienter med glioblastomer.

Konklusion

Fundet af de mange EGFR-mutationer i en række forskellige tumortyper kan vise sig at være et vigtigt skridt i retning mod en mere specifik udvælgelse og behandling af kræftpatienter. Især fundet af en korrelation mellem EGFR-tyrosinkinase-mutationer i NSCLC og respons på gefitinib har vakt opsigt, da det er viden, som kan implementeres direkte i klinikken. Alle mutationerne har dog det til fælles, at de er cancerspecifikke og derved kan bruges til selektivt at targetere en behandling rettet mod cancerceller uden at ramme vitale normale væv. Ydermere ser det ud til, at cellerne bliver fysiologisk afhængige af en øget mutant receptoraktivitet for opretholdelse af deres maligne fænotype. Dette betyder, at targeteret behandling af EGFR-mutantudtrykkende tumorer er lige for, og at en fortsat forskning i EGFR mutationers forekomst og tumorbiologiske funktioner derfor er vigtig.

Hans Skovgaard Poulsen , Strålebiologisk Laboratorium, Afsnit 6321, H:S Rigshospitalet, DK-2100 København Ø.
E-mail: hans.skovgaard.poulsen@rh.hosp.dk

Antaget: 5. januar 2006

Interessekonflikter: Hans Skovgaard Poulsen har modtaget bidrag til forskningsprojekt fra AstraZeneca

Taksigelser. Projektet er støttet af Kræftens Bekæmpelse via bevillingsnummer DP04087. Tak til Mette Villingshøj for kritisk gennemlæsning af manuskriptet.

1. Dei Tos AP, Ellis I. Assessing epidermal growth factor receptor expression in tumours: what is the value of current test methods? Eur J Cancer 2005; 41:1383-92.
2. Ang KK, Berkey BA, Tu X et al. Impact of epidermal growth factor receptor expression on survival and pattern of relapse in patients with advanced head and neck carcinoma. Cancer Res 2002;62:7350-6.
3. Pedersen MW, Meltorn M, Damstrup L et al. The type III epidermal growth factor receptor mutation. Biological significance and potential target for anti-cancer therapy. Ann Oncol 2001;12:745-60.
4. Pedersen MW, Pedersen N, Ottesen LH et al. Differential response to gefitinib of cells expressing normal EGFR and the mutant EGFRvIII. Br J Cancer 2005;93:915-23.
5. Yarden Y. The EGFR family and its ligands in human cancer. signalling mechanisms and therapeutic opportunities. Eur J Cancer 2001;37 (suppl 4):S3-S8.
6. Reiter JL, Threadgill DW, Eley GD et al. Comparative genomic sequence analysis and isolation of human and mouse alternative EGFR transcripts encoding truncated receptor isoforms. Genomics 2001;71:1-20.
7. Ogiso H, Ishitani R, Nureki O et al. Crystal structure of the complex of human epidermal growt