Skip to main content

Na + ,K + -pumpen vedbliver at overraske

Professor Bente Vilsen Aarhus Universitet, Institut for Fysiologi og Biofysik

26. maj 2008
9 min.

Na+,K+-pumpen (Na+,K+-ATPase) er en membranbundet »nanomotor«, der transporterer tre Na+-ioner ud og to K+-ioner ind i cellen for hvert ATP-molekyle, der spaltes som energikilde. Den aktive iontransport, som udføres af Na+,K+-ATPasen, udgør grundlaget for en række uundværlige celle- og vævsfunktioner. Således er koncentrationsgradienterne for Na+ og K+ skabt af Na+,K+-ATPasen nødvendige for elektrisk signalering via aktionspotentialer i nerver og muskler, ligesom det også er velkendt, at Na+-gradienten driver sekundær aktiv transport af en række andre ioner (bl.a. Ca2+, H+, I- og fosfat), neurotransmittere og aminosyrer (bl.a. serotonin, dopamin og glutamat), sukkerstoffer og lægemidler. I nyrens epitelceller er Na+,K+-ATPasen den drivende kraft for den Na+-reabsorption, der bestemmer hele organismens Na+-homøostase og dermed blodtrykket. Aktiviteten af Na+,K+-pumpen reguleres foruden af Na+- og K+-koncentrationerne af en række hormoner og hæmmes af hjerteglykosider (digitalis). Desuden er Na+,K+-pumpen i de senere år blevet tillagt en rolle som receptor i forbindelse med signaleringskaskader, der er uafhængige af transportaktiviteten.

Den 13. december 2007 markerede Nature 50-året for Jens Chr. Skous første publikation om Na+,K+-ATPasen [1] og 10-året for hans modtagelse af nobelprisen ved at pryde forsiden med molekylstrukturen af Na+,K+-ATPase-proteinet beskrevet i en artikel inde i bladet af forskere ved Institut for Fysiologi og Biofysik og Molekylærbiologisk Institut ved Aarhus Universitet [2]. Selv om Na+,K+-ATPasen har været udforsket i fem årtier, er der stadigvæk utrolig meget, vi ikke forstår, og det, at vi nu kender proteinstrukturen ( Figur 1 ), er et betydeligt fremskridt, der åbner nye muligheder for indsigt i Na+,K+-ATPasens mekanisme, regulering og betydning for sygdom.

Vores viden om Na+,K+-ATPasen har udviklet sig trinvist, først med Skous opdagelse af den Na+- og K+-aktiverede ATPase-aktivitet efterfulgt af beskrivelsen af enzymcyklus (Post-Albers-skemaet) med forekomsten af et såkaldt okkluderet intermediat, hvorfra K+-ionerne ikke kan dissociere uden en forudgående konformationsændring i proteinet, og i 1980'erne bestemmelse af aminosyresekvensen ved cDNA-kloning. De molekylærbiologiske teknikker muliggjorde også undersøgelse af de enkelte aminosyrers funktionelle betydning ved mutationsanalyse (site-directed mutagenesis). Ved overekspression af mutant-cDNA i cellekultur efterfulgt af funktionelle undersøgelser af mutantenzymet [3] blev det muligt at identificere en række aminosyrer, der er afgørende for binding af Na+- og K+-ioner og for de konformationsændringer, der finder sted i Na+,K+-ATPase-proteinet i forbindelse med transportprocessen.

Det første hint om pumpens dimensioner fik man allerede for ca. 30 år siden baseret på elektronmikroskopi af membranfragmenter [4]. Både dengang og nu var forudsætningen for strukturanalysen, at man fra nyrens ydre medulla kunne opnå en meget ren præparation af Na+,K+-ATPasen [5]. At det nu endelig er lykkedes at komme til at »se« pumpemolekylets bestanddele svarende til en opløsning så høj som 3,5 Å [2] skyldes, at det har været muligt at definere omstændigheder, hvorunder detergentekstraheret oprenset pumpeprotein holder sig nativt i ugevis og krystalliserer, så der kan udføres røntgendiffraktionsundersøgelser på præparatet. Principperne er bl.a. baseret på erfaring indhentet i studier, hvor det blev påvist, at K+-ionerne forbliver bundet i en stabilt okkluderet form efter detergentekstraktion [6].

Na+,K+-pumpe-proteinet er opbygget af en såkaldt α-kæde (blå i Figur 1), der indeholder bindingsstederne for ioner og ATP, og en β-kæde (lysebrun i Figur 1), der stabiliserer α-kæden og guider den ud til plasmamembranen, samt en γ-kæde, der tilhører familien af FXYD-proteiner, som i de senere år har vist sig at være vigtige for den vævsspecifikke regulering af Na+,K+-pumperne (rød i Figur 1). Det katalytiske sted, der er repræsenteret ved fosfatanalogen MgF4 -2 (orange i Figur 1), er lokaliseret i det cytoplasmatiske område af α-kæden. Strukturen afslører endvidere, at de to okkluderede K+-ioner er bundet tæt ved hinanden i en hulhed midt i α-kædens membranområde (pinkfarvede kugler i Figur 1). α-kæden har ti transmembrane helices M1-M10, hvoraf M4, M5 og M6 er direkte involveret i bindingen af K+-ionerne via aminosyresidekæder, der tidligere i mutationsstudier er påvist at være vigtige for K+-interaktionen. α-helix-strukturen er brudt i midten af M4 og M6, hvorved der opstår plads til ionerne. Når proteinstrukturen sammenholdes med resultaterne af mutationsstudier [7], er det muligt at nå til en forståelse af den mekanisme, hvorved indgangen til K+-okklusionshulen lukkes, når K+ bindes fra den ekstracellulære side, idet det ser ud til, at en glutamatsidekæde i M4 virker som et gate, der stabiliseres i den lukkede form ved interaktion med en leucinsidekæde i M1.

En overraskende detalje i strukturen er placeringen af den C-terminale ende af α-kæden (»halen«) i en lomme mellem β-kæden og de transmembrane segmenter M5, M7, M8 og M10 af α-kæden, hvor den danner hydrogenbindinger med M5, der er involveret i Na+-binding [3]. Denne tilsyneladende strategiske placering førte til, at den C-terminale hales betydning blev undersøgt ved genteknologisk at fjerne halen og studere de funktionelle virkninger heraf [2]. Forsøgene viste, at Na+-bindingen er betydelig påvirket i den haleløse pumpe (bindingsaffiniteten nedsat så meget som 26 gange). Dette peger på, at halen har en hidtil ukendt rolle i reguleringen af Na+-transporten, som måske styres af signaler, der påvirker halens position, såsom ændringer i membranpotentiale, proteinkinase A-medieret fosforylering af en nærliggende serin OH-gruppe, og/eller interaktion med FXYD-proteiner. Disse resultater sammenholdt med tidligere mutationsanalyser i M5, M6, M8 og M9 førte også til en hypotese for, hvor den tredje Na+-ion er bundet. De to øvrige af de tre Na+-ioner, der transporteres i en pumpecyklus, er sandsynligvis bundet på de samme steder som K+-ionerne i en konsekutiv transportmekanisme, hvor de transporteres ud af cellen, før K+-optages [2].

Et andet forholdsvist nyt aspekt af Na+,K+-pumpen er dens forbindelse til dominant arvelige neurologiske sygdomme. Der findes i det humane genom fire forskellige Na+,K+-ATPase-gener, der koder for forskellige α-kæde-isoformer med høj aminosyresekvenshomologi, og to af disse, α2 og α3, findes udtrykt i hjernen. Mutationer i α2-genet er årsag til den arvelige migrænesubtype familial hemiplegic migraine (FHM) type 2 (OMIM 602481), som i nogle tilfælde er kombineret med epileptiske anfald [8]. Mutationer i α3-genet forårsager den arvelige form for parkinsonisme familial rapid-onset dystonia parkinsonism (FRDP) (OMIM 128235) [9]. Der er på nuværende tidspunkt fundet mere end 30 forskellige α2-mutationer hos FHM-patienter, mens antallet af kendte FRDP-mutationer er noget mindre. For begge sygdomme kan den dominante arvegang forklares ved haploinsufficiens, dvs. at den mængde normalt fungerende Na+,K+-ATPase, der udtrykkes som følge af tilstedeværelsen af et normalt allel sammen med det muterede allel, ikke er tilstrækkelig til at sikre en normal funktion. Det er dog også muligt, at der forekommer dominant negativ påvirkning fra de muterede proteiner.

De patofysiologiske mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af henholdsvis FHM og FRDP er uopklarede. Da α2-isoformen udtrykkes i gliaceller, er der til forståelse af forbindelsen mellem Na+,K+-ATPase og FHM blevet fremsat den hypotese, at FHM er associeret med en svækket clearance af hjernens K+-indhold via nedsat gliacellefunktion. Neuronernes excitabilitet stiger, hvis den ekstracellulære K+-koncentration øges, og membranen derved depolariseres. I princippet kan denne situation opstå, hvis den maksimale Na+,K+-pumpeaktivitet i gliaceller reduceres på grund af nedsat enzymekspression eller nedsat katalytisk omsætningshastighed. Dette ville ramme både Na+- og K+-transport, mens en specifik virkning på K+ kunne være en følge af påvirkning af K+-affiniteten uden samtidig nedsættelse af den maksimale Na+,K+-pumpe-aktivitet. En anden mulighed er, at FHM opstår som følge af en ændret intracellulær Na+-koncentration og deraf følgende ændring i den intracellulære Ca2+-koncentration via Na+/Ca2+-exchange-systemet med konsekvenser for de signaleringskaskader, der udløses af Ca2+.

Der mangler i øjeblikket overbevisende hypoteser for mekanismen bag FRDP. α3-isoformen udtrykkes i neuronale celler. Flere af FRDP-mutationerne er fundet at reducere Na+-affiniteten på cytoplasmasiden, nogle direkte via en påvirkning af den Na+-bundne form af enzymet og andre indirekte via en ændring af konformationsligevægten mellem den Na+- og den K+-bundne form [10]. Man kan derfor forestille sig, at den intracellulære Na+-koncentration er steget i de neuronale celler, hvor mutanten udtrykkes. Spørgsmålet er, om denne funktionsændring repræsenterer en generel mekanisme for FRDP, således at andre FRDP-mutationer også må forventes at påvirke Na+-affiniteten. Ændringer i den intracellulære Na+-koncentration kan som beskrevet ovenfor medføre sekundære ændringer i Ca2+-koncentrationen. Derudover kan man også forestille sig, at den Na+-gradientdrevne optagelse af neurotransmitter (f.eks. dopamin) er påvirket. Et vigtigt fremtidigt mål for forskningen inden for dette område er at kortlægge sygdomsmutationernes virkninger både på det molekylære niveau med udgangspunkt i den nu kendte struktur af Na+,K+-pumpen og funktionelt i cellekultur og i dyremodeller, hvor mutationerne indføres transgent.


Bente Vilsen, Institut for Fysiologi og Biofysik, Aarhus Universitet, DK-8000 Århus C. E-mail: bv@fi.au.dk

Antaget: 17. marts 2008

Interessekonflikter: Ingen

Artiklen er skrevet på basis af forfatterens professortiltrædelsesforelæsning for at belyse aktive frontlinjeforskningsområder i Danmark.


  1. Skou JC. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim Biophys Acta 1957;1000:439-46.
  2. Morth JP, Pedersen BP, Toustrup-Jensen MS et al. Crystal structure of the sodium-potassium pump. Nature 2007;450:1043-50.
  3. Vilsen B. Mutant Glu781Ala of the rat kidney Na+,K+-ATPase displays low cation affinity and catalyzes ATP hydrolysis at a high rate in the absence of potassium ions. Biochemistry 1995;34:1455-63.
  4. Skriver E, Maunsbach AB, Jørgensen PL. Formation of two-dimensional crystals in pure membrane-bound Na+,K+-ATPase. FEBS Lett 1981;131:219-22.
  5. Jørgensen PL. Purification and characterization of (Na++ K+)-ATPase. III. Purification from the outer medulla of mammalian kidney after selective removal of membrane components by SDS. Biochim Biophys Acta 1974;356:36-52.
  6. Vilsen B, Andersen JP, Petersen J et al. Occlusion of 22Na+ and 86Rb+ in membrane-bound and soluble protomeric αβ-units of Na,K-ATPase. J Biol Chem 1987;262:10511-7.
  7. Einholm AP, An dersen JP, Vilsen B. Importance of Leu 9 in transmembrane segment M1 of the Na+,K+-ATPase in the binding and occlusion of K+. J Biol Chem 2007;282:23854-66.
  8. De Fusco M, Marconi R, Silvestri L et al. Haploinsufficiency of ATP1A2 encoding the Na+/K+ pump α2 subunit associated with familial hemiplegic migraine type 2. Nat Genet 2003;33:192-6.
  9. De Carvalho Aguiar P, Sweadner KJ, Penniston JT et al. Mutations in the Na+/K+-ATPase α3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism Neuron 2004;43:169-75.
  10. Rodacker V, Toustrup-Jensen M, Vilsen B. Mutations Phe 785Leu and Thr 618Met in Na+,K+-ATPase, associated with familial rapid-onset dystonia parkinsonism, interfere with Na + interaction by distinct mechanisms. J Biol Chem 2006;281:18539-48.

Summary

Summary The Na+,K+ pump continues to cause surprise Ugeskr Læger 2008;170(21):1821-1823 This article provides an overview of news about the Na+,K+ pump, an indispensable enzyme whose protein structure has been described in a recent article in Nature, 50 years after its discovery. In combination with mutational analysis, the structure reveals the binding pocket for the K + ions and the regulation of Na+ transport by a strategically located C-terminus of the protein. Focus is also on the pathophysiology of two neurological disorders, familial hemiplegic migraine and rapid-onset dystonia-parkinsonism, recently shown to be caused by mutations in the Na+,K+-ATPase.

Referencer

  1. Skou JC. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim Biophys Acta 1957;1000:439-46.
  2. Morth JP, Pedersen BP, Toustrup-Jensen MS et al. Crystal structure of the sodium-potassium pump. Nature 2007;450:1043-50.
  3. Vilsen B. Mutant Glu781Ala of the rat kidney Na+,K+-ATPase displays low cation affinity and catalyzes ATP hydrolysis at a high rate in the absence of potassium ions. Biochemistry 1995;34:1455-63.
  4. Skriver E, Maunsbach AB, Jørgensen PL. Formation of two-dimensional crystals in pure membrane-bound Na+,K+-ATPase. FEBS Lett 1981;131:219-22.
  5. Jørgensen PL. Purification and characterization of (Na++ K+)-ATPase. III. Purification from the outer medulla of mammalian kidney after selective removal of membrane components by SDS. Biochim Biophys Acta 1974;356:36-52.
  6. Vilsen B, Andersen JP, Petersen J et al. Occlusion of 22Na+ and 86Rb+ in membrane-bound and soluble protomeric αβ-units of Na,K-ATPase. J Biol Chem 1987;262:10511-7.
  7. Einholm AP, Andersen JP, Vilsen B. Importance of Leu 9 in transmembrane segment M1 of the Na+,K+-ATPase in the binding and occlusion of K+. J Biol Chem 2007;282:23854-66.
  8. De Fusco M, Marconi R, Silvestri L et al. Haploinsufficiency of ATP1A2 encoding the Na+/K+ pump α2 subunit associated with familial hemiplegic migraine type 2. Nat Genet 2003;33:192-6.
  9. De Carvalho Aguiar P, Sweadner KJ, Penniston JT et al. Mutations in the Na+/K+-ATPase α3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism Neuron 2004;43:169-75.
  10. Rodacker V, Toustrup-Jensen M, Vilsen B. Mutations Phe 785Leu and Thr 618Met in Na+,K+-ATPase, associated with familial rapid-onset dystonia parkinsonism, interfere with Na + interaction by distinct mechanisms. J Biol Chem 2006;281:18539-48.