Noninvasiv prænatal test er et gennembrud inden for prænatal screening

Den genteknologiske udvikling har i de seneste år gjort det muligt at undersøge et fosters kromosomer ud fra en blodprøve fra den gravide kvinde [1], hvilket er et gennembrud inden for prænatal screening. Allerede i 1969 fandt man føtale celler i moderens blod [2], og i 1997 fandt man cirkulerende fragmenteret cellefrit føtalt DNA, som stammede fra placenta, i det maternelle blod [3, 4]. Cellefrit føtalt DNA udgør ca. 10% af det totale frie DNA i moderens perifere blod ved en gestationsalder på ca. 10 uger [5]. Dette materiale har vist sig at være meget velegnet til prænatal screening [1, 4]. Frit føtalt DNA elimineres meget hurtigt og er forsvundet fra moderens blod 1-2 dage post partum, hvilket betyder, at man ikke risikerer interferens med frit føtalt DNA fra en tidligere graviditet [4]. I bl.a. USA har man siden 2011 kunnet tilbyde kvinder med høj risiko for at få et barn med bl.a. Downs syndrom (trisomi 21) screening ved undersøgelse af cellefrit føtalt DNA [6]. Testen bliver udbudt af private laboratorier, og i flere andre lande – herunder Danmark – er der igangsat initiativer med henblik på snarlig ibrugtagning af metoden. Det er dog ikke fuldt afklaret, hvilken gruppe af gravide kvinder der bør tilbydes denne noninvasive prænatale test (NIPT), eller hvordan man med metoden bedst kan supplere de eksisterende screeningstilbud.

Formålet med denne artikel er at beskrive de mest brugte teknikker til anvendelse af cellefrit føtalt DNA til screening for kromosomafvigelser. Ydermere vil vi diskutere den mulige fremtidige anvendelse af NIPT i relation til det eksisterende prænatale screeningsprogram i Danmark.

NUVÆRENDE PRÆNATAL SCREENING

I FØRSTE TRIMESTER I DANMARK

I Danmark tilbydes alle gravide screening for kromosomanomalier i form af en måling af den frie β-kæde af humant choriongonadotropin (hCGβ) og pregnancy associated plasma protein-A (PAPP-A) i den gravide kvindes blod ved en gestationsalder på 8-14 uger (doubletesten) og en ultralydskanning med måling af fosterets nakkefold ved en gestationsalder på 11-14 uger. Der foretages en risikoberegning ud fra moderens alder, nakkefoldens tykkelse og doubletesten. Hvis man ved denne undersøgelse påviser, at kvinden har en forhøjet risiko for at være gravid med et foster med trisomi 21 (Downs syndrom), trisomi 18 (Edwards syndrom) eller trisomi 13 (Pataus syndrom), tilbydes hun en invasiv diagnostisk undersøgelse i form af en moderkageprøve (chorion villus-sampling) ved en gestationsalder på 11-14 uger eller en fostervandsprøve (amniocentese) fra fulde 15 ugers gestationsalder. Ulempen ved de to invasive teknikker er en procedurerelateret abortrisiko på 0,5-1% [7]. Den nuværende screening har en forholdsvis høj screen-positiv rate (ca. 5%) og en høj falsk negativ rate (ca. 10%) [7]. Der udføres i Danmark mere end 2.000 invasive procedurer hvert år, uden at fostrene har kromosomfejl [8]. Ca. 10% af de gravide får ikke foretaget screeningsundersøgelsen i første trimester. I Danmark fødes der hvert år ca. 20 børn med Downs syndrom.

DNA-TEKNIKKER TIL NONINVASIV PRÆNATAL TEST

Som beskrevet i indledningen kan cellefrit DNA isoleres fra det maternelle blod, og DNA’et kan benyttes til analyse allerede fra en gestationsalder på syv uger [9]. Oftest venter man dog til uge 10 for at undgå falsk negative test, idet fraktionen af cellefrit føtalt DNA stiger med stigende gestationsalder [10].

Selve testen bygger på next generation sequencing [1, 4], hvor man opformerer millioner af mindre stykker DNA, som er isoleret fra blodet (Figur 1). Dernæst bestemmes den præcise rækkefølge af baserne i DNA’et, også kaldet sekventering. Alle disse stykker af DNA-basepar – såkaldte reads – sammenlignes med et humant referencegenom (det samlede genmateriale fra et menneske), og pga. den unikke rækkefølge af basepar sorteres DNA-stykkerne svarende til de forskellige kromosomer. Antallet af reads for hvert kromosom sammenholdes med det antal, man finder hos en gravid kvinde med et foster med normal kromosombesætning, og hvis antallet af reads for et bestemt kromosom overstiger det normale – f.eks. for kromosom 21 – tyder det på overskydende kromosommateriale.

Det er vigtigt at kende fraktionen af frit føtalt cirkulerende DNA. Er fraktionen for lille, vil det ikke være muligt at detektere stigningen i antallet af reads for det pågældende kromosom. En forklarende grund til en for lille fraktion er overvægt hos den gravide, ligesom rygning og etnicitet kan influere på niveauet [11]. Kromosom 21 udgør 1,5% af det humane genom. Hvis den føtale fraktion af frit cirkulerende DNA udgør 10%, vil DNA fra kromosom 21 stige til ca. 1,58% i graviditeter med trisomi 21. Denne lille stigning kan påvises med next generation sequencing-teknologien [1].

Der er principielt to forskellige sekventeringsteknikker: massively parallel shotgun sequencing (MPSS), hvor man benytter sekventering, således at hele genomet repræsenteres, og targeted sequencing, hvor der specifikt sekventeres bestemte regioner af interesse i genomet. For at opnå et validt resultat kræves der for begge teknikker, at genmaterialet dækkes af et minimum af sekventerings-reads. Med MPSS-teknikken kræves der 20-25 mio. reads fra hele genomet, for at analysen for trisomi 21 er pålidelig [1]. På nuværende tidspunkt udgør de kromosomer, som primært undersøges ved NIPT (trisomi 21, 18 og 13) kun en lille del af den totale MPSS-datamængde. Alligevel foretrækkes MPSS til screening for trisomi. Dette skyldes, at man forventer, at MPSS på sigt vil kunne anvendes til undersøgelse for andre former for kromosomale abnormiteter (store insertioner og deletioner). Sammenlignes laboratorie-

og analysetid med pris pr. prøve for henholdsvis targeted sequencing og MPSS, er der ikke den store forskel. Pris pr. prøve i offentligt regi vil formentlig blive på

ca. 5.000 kr. og analysetiden være ca. en uge. Pris og svartid forventes begge at falde.

ANVENDELSE AF NONINVASIV

PRÆNATAL TEST TIL SCREENING

Som tidligere nævnt anvendes NIPT primært med henblik på screening for autosomale trisomier (trisomi 21, 18 og 13). Teknikken kan ligeledes anvendes til screening for kønskromosomaneuploidier som Klinefelters syndrom (47, XXY) og Turners syndrom (45, X) [12], men med en dårligere detektionsrate. Fosterets køn kan også bestemmes ved denne metode, idet tilstedeværelsen af genmateriale fra Y-kromosomet i moderens blod vil betyde, at hun bærer på en dreng. Dette kan have klinisk betydning ved arvelige kønsbundne sygdomme, eksempelvis Duchennes muskeldystrofi [13]. Teknikken forventes snart at kunne benyttes til detektion af arvelige sygdomme, hvor faderen bærer en sygdomsfremkaldende mutation [14]. Endvidere er der inden for de seneste par år rapporteret om succesfuld brug af teknikken til detektion af recessive sygdomme [14] og til sekventering af hele fosterets genom [15, 16]. Disse analyser er dog vanskeligere, idet de kræver mere avanceret bioinformatik og en højere sekventeringskapacitet, men de kan formentlig blive klinisk mulige i fremtiden.

Der er gennem de senere år udført en del større

studier, hvor man har evalueret NIPT til screening for trisomier. I hovedparten af disse studier har man testet kvinder, som har haft en høj risiko for, at der hos fosteret var kromosomale aneuploidier (høj alder, positiv screening vha. serologi/skanning eller tidligere graviditet med aneuploidi) [4], men der er for nylig publiceret studier, hvori der også er inkluderet kvinder med lav

risiko for aneuploidier, dvs. en standardscreeningspopulation [6, 17-20]. I en metaanalyse af Gil et al er resultaterne af studier fra perioden januar 2011-januar 2015 af NIPT til screening for trisomi 21, 18 og 13 samt kønskromosom aneuploidier sammenfattet [21]. Detektionsraten for trisomi 21 var 99,2%, og falsk positiv-raten var 0,09% (Tabel 1). Detektionsraterne for trisomi 18 og 13 var henholdsvis 96,3% og 91,0%, og tilsvarende falsk positive rater henholdsvis 0,13% og 0,13% (Tabel 2). Detektionsraten for Turners syndrom var 90,3% (falsk positiv rate 0,23%) og for andre kønskromosomaneuploidier 93,0% (falsk positiv rate 0,14%). Der findes endnu kun få studier, hvori man har undersøgt testens værdi hos tvillinger, men det tyder på, at detektionsraten for trisomi 21 er noget lavere i tvillingegraviditeter end i singletongraviditeter [21].

Analysen er mest robust til screening for trisomi 21, hvilket kan hænge sammen med, at basesammensætningen (især GC-indholdet), kromosomstørrelsen og antallet af repetitive DNA-sekvenser varierer for de forskellige kromosomer [22]. Desuden er de fleste trisomi 21-fostre meiotisk opstået, og confined placental mosaicism (placentamosaicisme) for trisomi 21 er sjælden. Placentamosaicisme kan generelt udgøre et problem ved NIPT. Ved denne tilstand har fosteret et normalt antal kromosomer, men en procentdel af cellerne i placenta har trisomi, hvilket kan medføre et falsk positivt svar ved NIPT.

IMPLEMENTERING AF NONINVASIV PRÆNATAL

TEST I DEN PRÆNATALE SCREENING

OG STATUS I DANMARK

Det er endnu ikke afgjort, hvorledes denne nye screeningsmetode kan indføres i det eksisterende screeningsprogram. Den nuværende første trimester-screening, der også inkluderer en nakkefoldsskanning, giver nogle flere kliniske informationer og mulighed for tidligt at påvise andre lidelser eller misdannelser, hvilket ikke er muligt med NIPT alene. NIPT er for nuværende kun anvendelig til screening for trisomier, og et abnormt resultat skal følges op med en diagnostisk, invasiv test [23]. Det er vigtigt, at den gravide rådgives om dette, og om at testen kan være falsk positiv eller falsk negativ. I et nyligt publiceret dansk studie har man undersøgt, hvor mange genetiske anomalier ud over trisomier man ville have overset, hvis man kun havde udført NIPT i stedet for den nuværende screening [8]. Over en fireårsperiode i Danmark blev 193.638 gravide screenet, og heraf fik 10.205 (5,3%) udført en invasiv test på baggrund af alder, doubletest og nakkefoldsskanning. Ud af disse havde 1.122 (11%) fostre genetiske anomalier, hvoraf igen 262 (23,4%) ikke ville være blevet

påvist med NIPT, idet de ikke var trisomier. De »atypiske« anomalier var særligt hyppige blandt kvinder over 45 år, ved nakkefoldstykkelse ≥ 3,5 mm eller ved abnorme niveauer af hCGβ eller PAPP-A. Forfatterne konkluderede på baggrund af dette, at NIPT på nuværende tidspunkt vil være uegnet som eneste screeningstest til alle gravide og ikke bør anvendes ved graviditeter, hvor risikoen ved den nuværende screening er meget høj (> 1:100). En diagnostisk invasiv test vil fortsat være det bedste tilbud til disse gravide. En mulighed kunne være at tilbyde NIPT til de kvinder, der har en intermediær risiko for trisomier i det nuværende screeningsprogram (f.eks. 1:300 til 1:1.000), en gruppe, der i dag ikke tilbydes yderligere undersøgelser. Endelig kunne NIPT tilbydes til de kvinder, der har en høj risiko ved den kombinerede screening, men som ikke ønsker en invasiv procedure. Det er i denne situation vigtigt at informere om, at NIPT ikke er en diagnostisk test som de nuværende undersøgelser (kromosomundersøgelse og
array-CGH). Den for tiden faldende pris for NIPT vil formentlig betyde, at man på et tidspunkt vil overveje at tilbyde NIPT til alle gravide som supplement til de nuværende undersøgelser.

Foreløbig bliver screening for autosomale trisomier (trisomi 21, 18 og 13) med NIPT-teknikken ikke udført på danske laboratorier, men på flere private fertilitets- og ultralydklinikker i Danmark tilbyder man NIPT,

hvor selve analysen foretages på laboratorier i udlandet. Flere initiativer, der kan bane vejen for indførelse af testen i Danmark, er på vej, bl.a. på Hvidovre Hospital (Figur 2).

KONKLUSION OG PERSPEKTIV

NIPT på cellefrit føtalt DNA i moderens blod er et gennembrud inden for prænatal screening og vil uden tvivl blive implementeret i det danske screeningstilbud for trisomier. Teknikken har endvidere potentiale til i fremtiden at kunne benyttes til undersøgelse for andre genetiske lidelser. I studier har man fastslået, at NIPT har en høj detektionsrate i forbindelse med screening for særligt trisomi 21. Det er dog vigtigt at informere den gravide om, at NIPT ikke er en diagnostisk test, og hvis resultatet indikerer, at fosteret har trisomi, skal testen følges op af en invasiv prøve.

Korrespondance: Louise Stig Hornstrup.

E-mail: louisehornstrup@hotmail.com

Antaget: 15. april 2015

Publiceret på Ugeskriftet.dk: 6. juli 2015

Interessekonflikter: