Primære tarmstamceller kan anvendes til afklaring af sygdomsmekanismer

Dyrkning af stamceller er en kompleks proces, der indebærer måneders eller års optimering af metoden, dels for at kunne holde cellepopulationen stabil og i live, dels for at forhindre uddifferentiering til andre celletyper. Således kan en række pluri- og multipotente stamceller i dag dyrkes og anvendes i stamcelleforskningen, hvor det langsigtede mål er regenerativ medicin [1-3]. Her er målet at kunne dyrke bestemte celletyper eller væv for på sigt at kunne hjælpe patienter, som har enten arvelige sygdomme, f.eks. diabetes, og vil have gavn af nye betaceller, eller traumepatienter, der kan modtage ny hud, knoglemarv eller organer. Der foregår således en massiv indsats for at blive i stand til at dyrke specifikke celletyper – og endnu mere i bestræbelserne på at kunne kontrollere disse cellers differentiering. Dette er et vigtigt fokusområde for at kunne frembringe færdigudviklede celletyper og for at kontrollere disse celletyper med henblik på at undgå celledød eller forøget celledeling.

Det har tidligere ikke været muligt at have langtidskulturer af humane væv, men for blot få år siden kom der et gennembrud i dyrkningen af stamceller inden for gastroenterologien, idet en hollandsk forskningsgruppe præsenterede dyrkningen af stamceller fra mus og tillige beskrev, hvordan man kunne differentiere disse stamceller til moden tarm [4]. Siden 2009 er denne teknik blevet videreudviklet, og i 2011 lanceredes et modelsystem til dyrkning af humane intestinale stamceller [5]. Dyrkningen af humane tarmceller er langt mere kompleks end dyrkning af celler fra mus, og det er med brugen af denne protokol lykkedes at dyrke både normal tynd- og tyktarmsepitel samt kolorektal cancerepitel og metaplastisk øsofagusepitel.

Stamcellerne til disse kulturer kommer fra kryptbunden fra enkeltbiopsier udtaget fra patienters gastrointestinalkanal ved en endoskopisk procedure (Figur 1). Efter isolering fra biopsien kan stamcellerne dyrkes og ekspanderes i tredimensionale kulturer i matrigel, som er en blanding af bl.a. laminin og kollagen, der efterligner basalmembranen [6]. Her danner cellerne spontant sfæriske strukturer, de såkaldte organoider. Organoiderne gror herefter op over de næste 1-2 uger, hvorefter de skal »passeres« (dvs. fraktioneres mekanisk og genindstøbes). Dette gøres ved mekanisk at fraktionere cellerne og indstøbe en del af fragmenterne i matrigel igen. Celleklumperne vil over de følgende to døgn igen spontant danne nye organoider, der ligeledes vokser i størrelse indtil næste passage. Under passagen kan organoiderne ekspanderes i antal i et reproducerbart modelsystem [5]. På nuværende tidspunkt er der efter halvandet års dyrkning af en enkelt kultur endnu ikke nået en grænse for cellernes replikative potentiale, den såkaldte Hayflick-grænse [7], hvilket på sigt vil føre til aldring (senescence) og celledød på grund af afkortning af disse cellers genetiske telomerregioner. Yderligere er integriteten af disse organoider blevet undersøgt, og efter et halvt års dyrkning har der ikke været transkriptionelle eller karyotypiske ændringer at spore [5].

Organoiderne er ikke blot en samling stamceller, der kan holdes i live; deres potentiale er langt mere vidtgående. Ved at stimulere cellerne på den korrekte måde kan deres differentiering til moden tarm kontrolleres. Det er således muligt at skabe en model af den normale humane tarm, hvor det er påvist, at alle tarmspecifikke markører for tarmens celletyper kan genfindes i disse organoider [8]. Samtidig har elektronmikroskopiske billeder tillige afsløret en udviklet mikrovillusmembran i kulturer, der er deriveret fra human tyndtarm [4].

På alle måder ligner disse organoidstrukturer den humane tarm, og det er påvist, at systemet er stabilt, reproducerbart og relativt nemt at arbejde med, hvorfor stamcelleforskningen besidder store potentielle muligheder inden for en lang række forskningsmæssige og kliniske områder.

POTENTIALET FOR STAMCELLER I
LÆGEMIDDELUDVIKLING

Stamceller er i de seneste årtier blevet udråbt til det nye håb inden for den regenerative medicin. Hvorom alting er, så er udsigterne stadig lange, for at dyrkning af organer eller dele heraf bliver en integreret del af vores behandlingssystem. Et aspekt, hvor stamceller har vist sig særdeles velegnede, er som modelsystemer for nogle af de mekanismer, der foregår i kroppen [9]. Stamceller kan i denne henseende danne relativt simple regenererende modeller, som – hvis deres differentiering til funktionelle celletyper kan styres - kan skabe muligheder for lægemiddelforskning og øget forståelse for både de basale processer samt processer, der er relateret til sygdom, i den humane organisme.

Langt størstedelen af den moderne medicin er udviklet på baggrund af viden om intracellulære signaleringsmekanismer eller intercellulære mediatorer, der ligger til grund for en given lidelse. På baggrund af grundforskning i disse mekanismer bliver lægemiddelkandidater udvalgt og undersøgt i en lang række modeller med henblik på at studere deres effekt og eventuelt utilsigtede (bi)virkninger [10].

Hidtil er størstedelen af disse undersøgelser først foretaget i in vitro-systemer med cellelinjer – og sidenhen i dyremodeller. Selvom man kan komme langt med disse modeller i relation til virkningsmekanismer, sikkerhed og dosering, er det et faktum, at størstedelen af de lægemiddelkandidater, der passerer disse test, alligevel aldrig når på markedet. Den hyppigste grund til dette er manglende effekt, når lægemiddelkandidaten testes i fase II-studier. Med andre ord er vores nuværende dyremodeller simpelthen for ringe og translationen mellem forsøgsdyr og mennesker for lille [11, 12].

Som første trin udføres undersøgelser af nye lægemidlers effekt og sikkerhed i cellemodeller eller simple organismer. Disse forsøg bygger ofte på veletablerede cellelinjer, som i mange tilfælde er etableret årtier tilbage [13, 14]. Undersøgelser af sådanne cancerderiverede cellelinjer (f.eks. caco-2, HT29) eller immortaliserede celler viser ofte abnorme karyotyper, en høj grad af mutationer samt ændrede vækstmønstre og reaktioner på eksempelvis vækstfaktorer versus den virkelighed, de forventes at repræsentere i den menneskelige organisme [15].

På det andet trin med forsøgsdyr findes der også flere faldgruber inden for forskning og udvikling. Valget af dyreart er essentielt for udkommet og translationen af forskningsresultater i relation til den humane organisme, og prisen er ofte en vigtig faktor for dette valg. Der findes således mange eksempler på kliniske studier, der er blevet afsluttet på grund af manglende effekt hos mennesker, selv om der forudgående var observeret effekt hos dyr [12], bl.a. brugen af human rekombinant interleukin-10 til inflammatorisk tarmsygdom [16], hvor forudgående undersøgelser med brug af en eksperimentel kolitismodel havde vist gunstig effekt [17].

TERAPEUTISKE POTENTIALER VED BRUG AF PRIMÆRE TARMCELLEKULTURER

Da de humane tarmderiverede organoider både fysiologisk og molekylært ligner den humane tarm, besidder de et stort forsknings- og behandlingsmæssigt potentiale. For det første kan en række molekylære mekanismer i tarmen undersøges i langtidsforsøg, hvilket ikke tidligere har været muligt. Oplagte områder er absorption, distribution, metabolisme og ekskretion, som har betydelig relevans inden for både farmakologien og toksikologien. I lægemiddelsammenhænge vil dette potentielt kunne udvikles til et vigtigt modelsystem, hvor stoffer kan testes direkte der, hvor de senere tiltænkes anvendt hos mennesker. Andre vigtige områder vil være forskning inden for behandling af sår, hvor de regenerative mekanismer som proliferation, migration og differentiering kan undersøges i detaljer ex vivo i et reproducerbart modelsystem. Et andet stort forskningsområde, der kan revolutioneres gennem brug af dette setup, er inflammation. I dette modelsystem kan de cellulære mekanismer i epitelet undersøges som respons på en række forskellige eksterne stimuli. Eksempelvis kan immunmedierede sygdomme undersøges efter induktion med cytokincocktails, der efterligner et givent immunrespons, eller et inflammatorisk respons kan initieres ved enten tilsætning af aktiverede inflammatoriske celler eller ved stimulering med diverse patogener [18-20].

I eksempelvis gastroenterologien vil efterligning af den inflammatoriske tilstand ved inflammatorisk tarmsygdom give mulighed for at undersøge og følge de sygdomsprocesser, der aktiveres som følge af sygdommen. Endvidere er transfektioner af disse celler i dag en mulighed, hvorved man kan undersøge konsekvenserne af enten at introducere eller at fjerne genetisk materiale. Da en enkelt stamcelle kan danne ophav til hele organoider, kan sådanne undersøgelser udføres på klonalt niveau på kort tid og således blive analyseret få uger efter, at biopsien er udtaget.

En stor fordel ved dette relativt nye forskningsområde er muligheden for at koble et biologisk system til de diagnostiske værktøjer, der anvendes i dag - og på denne måde få koblet et funktionelt aspekt til diagnosticeringen af sygdomme. Man kan betragte dette som en levende biobank, der let kan undersøges og sammenholdes med eksempelvis diagnostiske ekspressionsanalyser eller lignende hos den enkelte patient, og hvor en given sygdomshypotese så kan testes i et levende system. Det beskrevne modelsystem kan være med til at bygge bro hen mod den personlige medicinering ved en række af sygdomme - eller til evaluering af behandlingseffekter. Eksempler herpå kan være et forløb, hvor en given behandlingsform skal optimeres hos enkeltpatienter i relation til dosering og effekt. Ved brug af dette system vil der ikke være risici for toksicitet hos den enkelte patient - og en række behandlingskombinationer vil kunne testes sideløbende. Andre eksempler kan være undersøgelser af genekspressionsændringer eller metaboliske ændringer i tarmen som følge af medicinering - eller af patientens reaktion på forskellige patogener eller inflammatoriske stimuli i et isoleret epitelsystem.

FREMTIDIGE PERSPEKTIVER

Hidtil er der blevet opsat adskillige mere eller mindre realistiske målsætninger for stamcelleforskningen. Det samme er sket inden for udviklingen af den beskrevne metode omkring brugen af organoider fra den humane tarm. Indtil videre bør man imidlertid betragte systemet som et ex vivo-system, der er et supplement til de nuværende metoder inden for forskning og diagnostik. Der er dog allerede opnået imponerende resultater af mere vidtgående karakter, og det er blandt andet i en eksperimentel murin kolitis-model påvist, at organoider, som er dyrket fra musetarm, kan sætte sig fast i den syge tarm. De transplanterede celler har siden kunnet genfindes over seks måneder efter indgrebet, hvilket vidner om systemets robusthed og potentiale i fremtidens kliniske forskning og terapi [21].

Korrespondance: Christoffer Søndergaard, Gastroenheden, Medicinsk Sektion, Herlev Hospital, Herlev Ringvej 75, 2730 Herlev.
E-mail: christoffer.soendergaard@regionh.dk

Antaget: 29. august 2013

Interessekonflikter: Forfatternes ICMJE-formularer er tilgængelige sammen med artiklen på Ugeskriftet.dk