Akademisk afhandling
In situ-detektion af RNA ved brug af cirkelprober og rullende cirkel-DNA-syntese
25. jan. 2008
2 min.
Denne ph.d.-afhandling er udfærdiget ved Patologisk Institut, Århus Universitetshospital, Århus sygehus. Formålet med ph.d.- projektet var at udvikle en sensitiv in situ-detektionsmetode som, ved brug af cirkelprober og rullende cirkel-DNA-syntese kunne bruges til detektion af enkelte RNA-molekyler. Dette har resulteret i to nye cirkelprobedesign: Turtle Proben og Slicer Proben.
Den første probe type vi udviklede var Turtle Proben, som vi har brugt til detektion af ikkepolyadenylerede RNA-molekyler (rRNA, EBER1 og hTR). Proberne blev hybridiseret til den 3'-enden af RNA-molekylet, ligeret til en lukket DNA cirkel, og rullende cirkel-DNA-syntese blev påbegyndt, primet fra 3'-enden af RNA-molekylet. Rullende cirkel-DNA-syntese resulterer i et langt stykke DNA bestående af repeterede sekvenser med en komplementær sekvens af proben, og dette repeterede DNA kan nemt detekteres ved hjælp af FISH. Da den rullende cirkel-DNA-syntese er primet fra 3'-enden af RNA-molekylet, vil den repeterede sekvens desuden blive kovalent bundet til 3'-enden af RNA-molekylet, hvilket sikrer en perfekt signallokalisering. På grund af at denne metode kræver både hybridisering og tilstedeværelsen af en 3'-ende i RNA-molekylet, vil risikoen for uspecifikke signaler, hvor proben klistrer eller binder uspecifikt i præparatet, minimeres.
Hvis RNA-molekylet, man vil detektere, er polyadenyleret, eller den eksisterende 3'-ende af RNA-molekylet ikke kan bruges til at prime reaktionen, eksempelvis hvis sekvensen man vil detektere er midt i RNA-molekylet, er det nødvendigt at bruge en andet type Cirkel Probe. Til dette formål har vi designet Slicer Proben, som er en cirkelprobe indeholdende et DNA-enzym. DNA-enzymer er DNA-sekvenser som, ved hjælp af divalente metalioner som ko-faktorer, kan udføre specifikke kemiske reaktioner. Ved at inkludere et DNA-enzym i den hybridiserende del af proben bliver proben i stand til at kløve RNA-molekylet og derved generere en ny 3'-ende på hybridiseringsstedet. Denne nye 3'-ende kan så bruges til at prime den rullende cirkel-DNA-syntese, hvis produkt efterfølgende detekteres med FISH.