Somatic cell nuclear transfer in pigs

Ph.d.-projektet er udført fra 2006 til 2009 på Institut for Genetik og Bioteknologi, Det Jordbrugsvidenskabelige Fakultet, Aarhus Universitet, med det formål at undersøge veje til at øge effektiviteten af den såkaldte handmade kloningsteknik (HMC) og dens anvendelse til kloning af grise, herunder transgene grise. Ph.d.-afhandlingen er baseret på seks publikationer og indledes med en oversigt over teknikker til produktion af transgene dyr med særlig vægt på kloning ved brug af somatiske celler. HMC er en sådan teknik, og den beskrives i detaljer. De epigenetiske og mitokondrielle aspekter ved at bruge differentierede somatiske celler til kloning diskuteres.

Ved HMC fjernes det DNA-holdige kromatin ved skarp tvedeling af oocytten med mikroskalpel, hvorefter den kromatinløse cytoplast selekteres vha. UV-fluorescens til fusionering med donorcellen, en normal eller genmodificeret fibroblast. Blastocystraten, dvs. procentdelen af sådan rekonstruerede embryoner, som udvikler sig til blastocyststadiet i løbet af seks dages inkubation in vitro, bruges som mål for kloningseffektiviteten. Undersøgelserne viser, at denne effektivitet kunne øges, ved at man undlader farvning med fluorokrom og UV-belysning og i stedet foretager en asymmetrisk tvedeling af oocytten med første pollegeme som landkending.

Yderligere effektivitet kunne opnås ved at inkubere oocytterne med stoffet demecolcine, som interfererer med mikrotubuli, idet det meiotiske tentrådsapparat nu fremtrådte som en synlig prominens og dermed mere pålideligt som landkending under tvedelingen.

Hypotesen, at kloningssvigt kan skyldes abnorm epigenetisk reprogrammering af genomet i det rekonstruerede embryon, testes ved at inkubere embryon i trichostatin A og dermed inhibere histon deacetylase, som er en vigtig epigenetisk regulator. Øget blastocystproduktion kunne påvises, og ved overførsel til recipient blev det påvist, at kombinationen af HMC og trichostatin A-behandling er forenelig med fødsel af levende grise.

Modificeret HMC blev herefter anvendt til kloning af de første klongrise, der er født i Danmark, samt kloning og fødsel af de første grise, der er transgene for Alzheimer-genet APP695sw. Teknikken viste sig at være lige så effektiv som traditionel kloning, der kræver megen øvelse, tid og brug af dyr mikromanipulator. Det er nu åbnet som en realistisk mulighed at fremstille genmodificerede grise som model for såvel genetiske sygdomme som sygdomme, hvor samspillet mellem genetiske og miljømæssige faktorer har betydning.