CRISPR/Cas-geneditering af humane stamceller til kurativ behandling af primær immundefekt

Primære immundefekter (PID) er oftest monogene arvelige sygdomme, som manifesterer sig med sygdom relateret til immundysregulering (derfor også benævnt inborn errors of immunity) med varierende grader af øget infektionstendens, autoimmunitet, autoinflammation, allergi og øget malignitetsrisiko. Symptombilledet afhænger af den genetiske defekt, og der er nu beskrevet mere end 500 individuelle sygdomme [1]. PID er således en heterogen gruppe af sjældne, arvelige tilstande forårsaget af genvarianter, der påvirker proteiner involveret i det innate og/eller det adaptive immunforsvar. Varianterne nedarves på forskellig vis og udviser ikke altid fuld klinisk penetrans. Defekterne kan involvere bestemte typer immunceller, receptorer, intracellulære signalmolekyler, transkriptionsfaktorer, cytokiner eller cellulære funktioner. Sygdommene forekommer hos 75% i barnealderen [2], men kan også debutere i voksenlivet med infektionstendens eller immundysregulering. Hyppigheden af PID er ukendt, men skønnes at være mellem 1/10.000 og 1/50.000. Dette tal er dog formentlig et underestimat, og efter screening af nyfødte ved hælblodprøve og implementering af helgenomsekventering i klinisk diagnostik vurderes frekvensen for svær kombineret immundefekt (SCID) alene at være 1/60.000 levendefødte børn [1]. Sygdommene er forbundet med en betydelig morbiditet og mortalitet, hvorfor kurativ behandling er et behandlingsmål. Ud over forebyggende tiltag med vaccination, antimikrobiel profylakse, immunglobulinsubstitution eller biologisk immunmodulerende terapi, er kurativ behandling for SCID og andre alvorlige PID hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT). Behandling kan med en acceptabel human leukocyt antigen (HLA)-kompatibel donor giver livslang immunrekonstitution hos ca. 90% af patienter men med en mindre risiko for immunologiske komplikationer herunder graft-versus-host (GVHD)-sygdom og livstruende infektioner.

Genterapi

Et alternativ til HSCT er genterapi af patientens egne hæmatopoietiske stamceller Her undgås brug af allogen donor, og derved elimineres risikoen for immunologiske komplikationer og GVHD. Genterapi foretages typisk med en lentiviral (LV)-vektor, som er en modificeret replikationsdefekt version af human immundefekt virus (hiv), som sikrer effektiv overførsel og kromosomal integration af det terapeutiske gen i patientens egne hæmatopoietiske stamceller [3, 4]. PID er særligt velegnede målsygdomme for autolog stamcellegenterapi, idet ekstraktion og dyrkning af hæmatopoietiske stamceller muliggør ex vivo-LV-genterapi. Flere genterapiforsøg har siden 1990’erne vist stor effektivitet i flere typer af PID: alvorlig kombineret immundefekt (ADA-SCID og SCID-X1), Wiskott Aldrichs syndrom (WAS) og kronisk granulomatøs sygdom (CGD)D [5-7]. Genterapi er dog ikke lige velegnet til alle PID og er ved nogle sygdomme ikke muligt af tekniske årsager. Trods effektiv behandling med LV-vektorer har flere patienter udviklet leukæmi, som skyldes indsættelse af det terapeutiske gen tæt på et protoonkogen og transaktivering af dette. Senest har syv ud af 67 patienter udviklet leukæmi i behandling af adrenoleukodystrofi, hvor målcellerne for LV-genterapi også var hæmatopoietiske stamceller [8]. I andre sygdomme har der dog ikke været observeret leukæmi eller tegn på insertional mutagenese, hvilket tyder på, at risikoen kan være specifik for den specifikke LV-vektor eller den pågældende sygdom [9]. Morbiditet og mortalitet i forbindelse med genterapi kan desuden relateres til den forudgående myelo- eller non-myeloablative konditionering, som i sig selv medfører toksicitet og øget risiko for infektioner og sekundær malignitet.

Redigering af genomet med CRISPR/Cas

CRISPR/Cas er en vigtig del af bakteriers forsvar mod virus (bakteriofager) og fungerer som en form for genetisk hukommelse fra tidligere infektioner, der gør det muligt at genkende og uskadeliggøre nye virusangreb. Betegnelsen clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) henviser til et lokus i bakteriers genom, hvor små DNA-fragmenter fra tidligere virusinfektioner lagres. Når bakterien senere udsættes for samme virus, bliver disse lagrede sekvenser transkriberet til små RNA-molekyler kaldet CRISPR RNA (crRNA). Disse crRNA-molekyler genkender og binder via baseparring til det indtrængende virus-DNA og guider dermed DNA-endonukleasen Cas (CRISPR-associeret) til det virale DNA. Dette fører til kløvning og henfald af DNA’et, hvilket forhindrer virusreplikation og beskytter bakterien mod infektion.

CRISPR/Cas-systemet kan tilpasses til helt andre formål i menneskeceller. Således viste Emmanuel Charpentier og Jennifer Doudna (Nobelprismodtagere i 2020), at Cas er aktivt i humane celler og kan målrettes en forudbestemt position i genomet i en proces styret af et designet RNA-molekyle kaldet single guide RNA (sgRNA) [10-12]. Den DNA-bindende del af sgRNA-molekylet kan tilpasses en relevant målsekvens og vil således via baseparring styre Cas til denne position i genomet. Men et klip i genomet er ikke i sig selv nok til at ændre på arvemassen. Det afgørende er, at cellens maskineri til reparation af DNA aktiveres i forbindelse med bruddet. Reparation via nonhomologous end joining (NHEJ) fører ofte til baseændringer i form af insertioner eller deletioner (indels) (Figur 1). Klippes der i et gen, vil dette typisk ødelægge læserammen og resultere i »knockout«. Er det til gengæld målet at introducere en bestemt ændring i genomet, f.eks. at korrigere en patogen genetisk variant, så er det nødvendigt at tilføre en såkaldt donor DNA-sekvens. Dette gør det muligt for cellen at reparere bruddet via homology-directed repair (HDR), hvor mekanismer for homolog rekombination anvender homologt donor-DNA som skabelon for reparation af det Cas-inducerede DNA-brud (Figur 1). Herved er det muligt at rette en genfejl nær det sted, hvor Cas klipper. Dette kaldes ofte »knockin« [13].

Begrænsninger ved homology-directed repair-baseret genredigering

HDR-baseret genredigering er kun muligt i celler, der deler sig, og i nogle sammenhænge kan effektiviteten derfor være lav. Ved anvendelse af teknologien er man desuden blevet opmærksom på, at CRISPR/Cas-inducerede DNA-brud i DNA kan aktivere cellulære DNA-skaderesponser, der bremser cellecyklus eller inducerer celledød. Hertil kommer en risiko for, at sgRNA-molekylet guider Cas til »forkerte« steder i genomet, hvilket kan føre til såkaldte »off-target« hændelser i form af klip og dermed introduktion af uønskede indels i arvemassen [12]. En mulig konsekvens af multiple brud i arvemassen er desuden kromosomtranslokationer. Der arbejdes på at udvikle mere præcise CRISPR-systemer og forbedrede metoder til at detektere og minimere disse effekter. To nyere CRISPR-baserede teknikker »baseeditering« og »primeeditering«, gør det muligt at rette genetiske mutationer med høj præcision uden dobbeltstrengsbrud og uden at tilføre donor-DNA [12, 13]. (Figur 1). Endelig er der stort fokus på, hvordan Cas og guide RNA kan leveres effektivt, præcist og sikkert, hvilket kan gøres enten med elektroporering, lipidnanopartikler eller modificerede viruspartikler [14-16].

Kliniske forsøgsbehandlinger med CRISPR/Cas

Behandlingsprocessen i forbindelse med ex vivo-geneditering af stamceller involverer isolering af patientens stamceller fra knoglemarven, kultivering i en bioreaktor, hvorunder Cas9, og syntetisk sgRNA leveres ved elektroporation og dernæst nedfrysning af cellerne, mens en lille andel kvalitetskontrolleres (Figur 2). Efter validering bliver patientens resterende stamceller helt eller delvis elimineret ved konditionering, ofte med busulfan, hvorefter de genmodificerede celler infunderes intravenøst og begynder at producere nye blodceller [12] (Figur 2). Den første kliniske anvendelse af CRISPR/Cas i vestlige lande var mod seglcelleanæmi og β-thalassæmi, begge forårsaget af varianter i β-globingenet [17]. I stedet for at korrigere patientmutationer har man udviklet en universel tilgang, hvor repression af gammaglobingenet ophæves ved knockout af BCL11A-genet, hvilket genetablerer føtalt hæmoglobin (HbF) og kompenserer for den manglende funktion af HbA. De kliniske afprøvninger af denne terapi med navnet exagamglogene autotemcel viste høj effektivitet og hidtil kurative resultater i begge sygdomme, og behandlingen blev i starten af 2024 godkendt ved Det Europæiske Lægemiddelagentur. Terapien blev i februar 2025 anbefalet af Medicinrådet og er dermed den første kommercielle CRISPR-terapi i Danmark [18, 19].

CRISPR/Cas-revolutionen og implementering som terapeutisk mulighed ved primære immundefekter

CRISPR/Cas er en medicinsk revolution af flere årsager. For det første muliggør teknologien, at man med en enkelt behandling kan kurere sygdomme, som tidligere ikke har kunnet behandles på grund af manglende målmolekyler eller egnede lægemidler [10, 12, 13]. For det andet er CRISPR/Cas fleksibel og simpel at omprogrammere til nye genvarianter, hvilket muliggør udvikling af ny medicin på få uger. Ved at ændre den DNA-bindende del kan en ny sgRNA hurtigt produceres via standardiseret RNA-syntese. Bred klinisk anvendelse til et større sygdomsspektrum er dog udfordret af begrænset leveringseffektivitet til afficeret væv grundet fysiske og immunologiske barrierer. Efter klinisk godkendelse er den næste udfordring de høje behandlingsomkostninger. Således udgør genterapier verdens fem dyreste lægemidler med listepriser fra 19,9 til 31,7 mio. kr. Balancen mellem omkostninger og fordele, herunder udbredelse til mindre sjældne sygdomme, vil derfor være en vigtig faktor i den fremtidige implementering af CRISPR-baserede terapier [12]. Den fleksible platformteknologi, som har lighed med mRNA-vacciner, er dog endnu ikke matchet af tilsvarende regulatoriske godkendelsesprocesser. I stedet kræver udviklingen af hver ny terapi en fuld præklinisk datapakke, som vurderes regulatorisk med hensyn til sikkerhed, effektivitet og off-target-effekter. På sigt er forhåbningen, at de regulatoriske krav balanceres, hvilket vil kunne facilitere skræddersyet medicin til de små og sjældne patientgrupper, der ikke har kommerciel interesse for medicinalvirksomheder, men hvor udviklingsarbejdet og behandlingerne kan varetages af akademiske eller nonprofitorganisationer. For det tredje har teknologien kurativt potentiale, hvilket til dels forklarer de eksorbitante priser De to konkurrerende godkendte CRISPR/Cas- og LV-baserede genterapier mod seglcelleanæmi og β-thalassæmi er prissat til henholdsvis 2,2 og 3,1 mio. dollars. Der er ingen klar tendens til, at den teknologiske modalitet i sig selv har afgørende betydning for prissætningen. I stedet synes faktorer som sygdommens alvorlighed og sjældenhed, dokumenteret klinisk effekt og forventede sundhedsøkonomiske gevinster at spille en større rolle i vurderingen af værdi og prissætning. De første skridt mod CRISPR/Cas-behandling af PID er taget med godkendelse af kliniske forsøg til kronisk granulomatøs sygdom (CGD)-patienter, hvor der testes genkorrektion både ved baseeditering og primeeditering (NCT06325709 og [20]). I Danmark arbejdes der i øjeblikket på udvikling af CRISPR/Cas-geneditering for sygdommene (CGD), hyper-IgE syndrom (HIES) og GATA-binding protein 2 (GATA2)-defekt ved HDR samt baseeditering og primeeditering af stamceller fra patienter. Dette sker på Aarhus Universitetshospital og Aarhus Universitet i regi af forskningscentret PASCAL-MID finansieret af Innovationsfonden.

Perspektiver og konklusioner

Siden identifikationen af de første genetisk betingede PID epidermodysplasia verruciformis (med udvikling af HPV-associerede papillomer og cancer) i 1946 samt Brutons X-bundne agammaglobulinæmi i 1952 er antallet og spektret af PID vokset betydeligt i takt med ny viden inden for basal immunologi samt udviklingen af helgenomsekventering til diagnostik og genterapi til behandling. Som beskrevet i denne statusartikel forekommer mulighederne for at anvende disse teknologier i klinisk og personlig medicin umiddelbart overvældende og nærmest ubegrænsede, og adskillige kliniske forsøg omfattende forskellige PID pågår aktuelt. De seneste års erfaringer har dog også afsløret adskillige tekniske, økonomiske og regulatoriske udfordringer, herunder uønskede effekter på genomintegritet og genekspression, som understreger vigtigheden af yderligere forsøg samt udviklingen af sekventeringsværktøjer til at garantere sikkerheden ved klinisk anvendelse. Der er dog ingen tvivl om, at CRISPR/Cas-geneditering er et potentielt meget effektfuldt og lovende redskab til kurativ behandling af en række alvorlige monogene sygdomme, hvortil vi i dag har utilstrækkelige eller manglende terapeutiske muligheder. Fremtiden vil vise, i hvilket omfang CRISPR/Cas-teknologien kan udfylde sit fulde potentiale til at revolutionere personlig medicin i behandling af PID med tilfredsstillende specificitet, stabilitet og sikkerhed.