CRISPR som funktionel kur af hæmoglobinsygdomme

Alvorlige hæmoglobinsygdomme såsom seglcelleanæmi (SCD) og transfusionskrævende β-talassæmi (TDT) udgør en betydelig global sundhedsbyrde med flere hundredtusinder børn født årligt på verdensplan [1]. SCD og TDT er autosomalt recessive sygdomme, der skyldes mutationer i HBB på kromosom 11, der koder for β-globin. I Danmark såvel som resten af Europa er både prævalens og incidens af hæmoglobinsygdomme stigende grundet øget antal individer med etnisk ophav i de endemiske områder uden for Nordeuropa [2-4].

Uden behandling er SCD og TDT ofte dødelige i barndommen. Moderne behandlinger kan forlænge levetiden med flere årtier, men patienterne har fortsat komplikationer og væsentligt nedsat livskvalitet [5, 6]. Hidtil har allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (HSCT) været den eneste kurative behandlingsmulighed, men behandlingen indebærer risiko for betydelig morbiditet samt mortalitet, og kun ca. 15% har en velegnet knoglemarvsdonor [6, 7].

Da β-globin udelukkende udtrykkes i knoglemarvens erytroide forstadier, er genkorrektion af HBB i hæmatopoietiske stamceller en mulig fælles kurativ behandling for patienter med SCD og TDT.

Transfusionskrævende β-talassæmi

β-talassæmi er karakteriseret ved mangel på β-globin, hvor ineffektiv dannelse af erytrocytter i knoglemarven og hæmolyse medfører svær anæmi fra 4-6-månedersalderen (Figur 1). Den kroniske hæmolytiske anæmi og jernophobning i væv medfører bl.a. væksthæmning, progredierende organskade på grund af jernophobning samt nedsat funktionsniveau og levetid.

Standardbehandlingen af transfusionsafhængig talassæmi er enten livslang fast blodtransfusion hver 2.-5. uge kombineret med jernkelerende behandling eller HSCT. HSCT udføres, gerne inden pubertet, typisk med en vævstypematchet søskendedonor.

Der er identificeret > 500 genvarianter i HBB, som kan forårsage β-talassæmi [8], hvilket komplicerer genterapi, der målrettet forsøger at korrigere specifikke genvarianter.

Seglellesygdom

Seglcellesygdom skyldes en aminosyresubstitution i β-globingenet benævnt HBB:c.20A>T (HbS). Seglcellesygdom omfatter: SCD, dvs. homozygoti for HbS; compoundheterozygot seglcellesygdom, dvs. HbS med en anden hæmoglobinvariant, f.eks. hæmoglobin C; seglcelletalassæmi, dvs. HbS i kombination med β-talassæmi. Mutationen medfører polymerisering af hæmoglobin, særligt når det deoxygeneres i perifere væv. Erytrocytterne bliver seglformede og ufleksible og okkluderer små blodkar, hvilket medfører smerter samt organskade (Figur 1) [9]. Standardbehandlingen af seglcellesygdom omfatter penicillinprofylakse (funktionel aspleni), pneumokokvaccination, hydroxyurea (øger fosterhæmoglobin (HbF)) og blodtransfusioner. Ved betydende komplikationer til sygdom eller behandling er der indikation for HSCT, også ved egnet ubeslægtet donor [10].

Debut af hæmoglobinsygdomme

Hverken β-talassæmi eller seglcellesygdomme er symptomgivende fra fødsel, da barnet stadig producerer betydelige mængder HbF. HbF er en tetramer bestående af to α-globiner og to γ-globiner (α₂γ₂). Funktionelt fungerer HbF glimrende og indeholder i modsætning til voksenhæmoglobin (HbA: α₂β₂) ikke β-globin. Symptomerne ved sygdomme udgående fra β-globingenet (β-talassæmi og seglcellesygdom) opstår derfor først måneder efter fødslen, hvor barnet i stigende grad forsøger at lave voksenhæmoglobin ved hjælp af β-globingenet.

Genterapi til hæmoglobinsygdomme

Genterapi til SCD og TDT baseret på en lentiviral vektor med raskt β-globin har været tilgængelig for amerikanske patienter i en årrække [11, 12]. Den blev godkendt af EMA i 2019, men firmaet bag trak sig fra EU grundet manglende godkendelse til ibrugtagning i medlemslandene. For over to årtier siden viste første generation af genterapi med retrovirus at inducere leukæmi hos næsten halvdelen af de behandlede personer [13]. Dette har medført omfattende fokus på, om nye lentivirale genterapier indebærer samme risiko. Hidtil synes risikoen for leukæmiudvikling at være beskeden med kun ét tilfælde beskrevet hos en patient med SCD [14].

Flere konkurrerende genterapier er under udvikling, som det fremgår af en nylig oversigtsartikel [15]. Flere er baseret på clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR). CRISPR/CRISPR-associeret (Cas) 9 eller CRISPR/Cas12 kan specifikt ændre gener i de hæmatopoietiske stamceller og antages derved at indebære mindre risiko for leukæmiudvikling end virusbaseret genterapi. CRISPR-systemet består af en guideribonukleinsyre, der præcist leder Cas-nukleasen til den ønskede DNA-sekvens. Dette muliggør målrettet kløvning og efterfølgende indsætning af alternativ DNA-sekvens, hvilket resulterer i korrektion af genet, uden dets regulatoriske kontekst påvirkes. Selv om dette er elegant, har det hidtil vist sig enklere at kløve DNA i hæmatopoietiske stamceller end at introducere en ny genkorrigeret DNA-sekvens. Derfor er de fleste CRISPR-baserede genterapier til hæmoglobinsygdomme p.t. baseret på at ødelægge transkriptionsfaktorer eller deres bindingssite og derigennem inducere transkription af γ-globin som erstatning for det defekte β-globin. Herved erstattes det defekte voksenhæmoglobin af HbF.

Ved behandlingen isoleres patientens hæmatopoietiske stamceller ved leukaferese, hvilket er en velafprøvet teknik til at høste stamceller ved andre stamcellebehandlinger. Stamcellerne tilføres herefter CRISPR/Cas-komponenterne i et laboratorium (f.eks. ved elektroporation), hvorefter den ønskede genredigering sker med særdeles høj præcision. Efter genredigeringen reintroduceres de korrigerede celler til patienten, hvor de integreres i knoglemarven og differentierer til blodceller, der bærer det rettede gen. Disse celler viderebringer genændringen ved celledelinger, hvilket fører til vedvarende produktion i knoglemarven af det korrigerede genprodukt.

CRISPR/Cas-teknologiens præcision medfører en lavere teoretisk risiko for insertionel mutagenese [16] sammenlignet med risikoen ved genterapi med traditionelle lentivirale vektorer, hvor der kun i begrænset omfang er kontrol over insertionssite.

Genetisk mål for CRISPR ved hæmoglobinsygdomme

BCL11A

BCL11A er en transkriptionel repressor af γ-globin, der er afgørende for et skift af produktion fra HbF til voksenhæmoglobin (HbA), og BCL11A er derved et attraktivt mål i behandlingen af β-globinsygdommene β-talassæmi og seglcellesygdom (Figur 2).

Personer med medfødte inaktiverende genetiske varianter i BCL11A eller i dets bindingssites i promoteren for γ-globingenet bliver ved med at producere HbF i betydelige mængder hele livet. Det er velkendt, at patienter med alvorlig hæmoglobinsygdom og samtidig persisterende HbF har milde forløb, og at niveauet af HbF er omvendt proportional med komplikationer og mortalitet. Patienter med HbF > 30% er typisk asymptomatiske.

Ved effektiv inaktivering af BCL11A i patientens egne hæmatopoietiske stamceller og dermed øget produktion af HbF udgør CRISPR-teknologien en funktionel kurativ behandling. Der er p.t. flere kliniske forsøg, som benytter dette princip. Behandlingen exagamglogenautotemcel er længst fremme og er EMA-godkendt og pr. februar 2025 også godkendt af Medicinrådet i Danmark på baggrund af to fase 3-forsøg til behandling af patienter over 12 år med TDT eller SCD [17, 18].

HBG1 og HBG2

HBG1/2 koder for γ-globin, og visse medfødte genvarianter i promotorregionen for disse gener er forbundet med persisterende HbF. Dette kan også fremkaldes terapeutisk via genterapi, f.eks. ved at ødelægge bindingssitet for BCL11A.

I RUBY-forsøget (NCT04853576) anvendes genterapien EDIT-301 med AsCas12a-enzymet til at ændre HBG1/2-promotoren og dermed øge niveauet af HbF hos patienter med svær SCD [19]. Tilsvarende benyttede OTQ923-genterapiproduktet CRISPR/Cas9 til at introducere ændringer i HBG1/2, hvilket i et fase 1-2-forsøg øgede HbF til klinisk meningsfulde niveauer [20]. Dog valgte firmaet at afbryde den videre udvikling af produktet [21].

Patientflow og behandling

Ex vivo-genterapi er en proces, hvor patientens egne hæmatopoietiske stamceller udtages og genmodificeres uden for kroppen, hvorefter de genindføres i patienten (Figur 3). Først høstes stamcellerne fra patientens blod. Ved genterapi ønskes et meget højt antal stamceller, og der kan derfor være behov for 2-3 mobiliseringsforløb. De udtagne stamceller behandles derefter med genterapi i et højt specialiseret laboratorium.

Efter høst og genmodifikation gennemgår patienten en forberedende behandling med højdosis kemoterapi (konditionering), typisk busulfan, der gør det muligt for de genediterede stamceller at kolonisere patientens knoglemarv [22].

Efter konditioneringen indgives de korrigerede celler i en vene, hvorfra de finder vej til knoglemarven. Det tager uger for de genkorrigerede stamceller at genetablere knoglemarvens funktion, og i denne periode vil patienten have anæmi, trombocytopeni og neutropeni. Den dybe og langvarige neutropeni udgør en risiko for alvorlige infektioner, hvilket dog kan forebygges med antimikrobiel behandling.

Behandlingen gør det muligt at opnå varig genetisk korrektion ved hjælp af patientens egne celler, hvilket i modsætning til en traditionel allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation ikke indebærer risiko for alloimmunreaktioner (graft versus host-sygdom). Omvendt er opfølgningstiden på genterapierne kortere og den endelige sikkerhedsprofil derfor ukendt.

Omkostninger og værdi af genterapi

Hæmoglobinsygdomme udgør globalt en enorm menneskelig og økonomisk byrde, som har nødvendiggjort etablering af forskellige typer forebyggende screeningsprogrammer [23]. Standardbehandlingen omfatter livslang medicinsk behandling, hyppige blodtransfusioner, indlæggelser og ikke mindst sociale ydelser til syge patienter, hvor f.eks. sygemeldinger, forlænget uddannelsestid og flexjob/førtidspension ikke er usædvanlige. Dertil kommer inddragelse af raske pårørende, særligt forældre, som kan have tabt arbejdsfortjeneste. De præcise omkostninger er dog svære at opgøre. Hvor vi rimeligt kender prisen på en pose blod, er det omvendt svært at værdisætte forebyggelse af invaliderende komplikationer såsom apopleksier hos børn med SCD. Genterapier repræsenterer en potentielt kurativ engangsbehandling, der kan eliminere udgifterne til livslang symptomatisk og palliativ behandling. Særligt for børn kan dette føre til betydelige økonomiske besparelser på længere sigt. Imidlertid er genterapi tilsvarende højt prissat, hvilket kan udgøre en væsentlig barriere for godkendelse og implementering. Disse omkostninger betyder også, at behandlingen foreløbig er uden for rækkevidde i de fleste udviklingslande, hvor sygdomsprævalensen er højest. I Danmark har Medicinrådet i en skelsættende afgørelse godkendt exagamglogenautotemcel til enten TDT eller svær SCD, hvor der ikke er en tilgængelig beslægtet stamcelledonor. Godkendelserne gælder i første omgang i to år og bygger på Medicinrådets alvorlighedsprincip, hvor der åbnes for højere omkostninger og mindre omfattende datagrundlag.

Genterapi kræver avancerede laboratoriefaciliteter, højt specialiseret ekspertise samt omfattende akkreditering. Kapaciteten til denne type behandling deles med en række andre »advanced therapy medicinal products« såsom chimeric antigen-receptor T-celleterapi til kræftsygdomme, hvor der i disse år sker en voldsom ekspansion.

Konklusion

Selv om den senere nobelprismodtager Linus Pauling allerede i 1949 udnævnte SCD til »den første molekylære sygdom« [24], er der kun udviklet få præparater til behandling af sygdommen. I modsætning hertil er udviklingen af genterapi, herunder CRISPR, gået hurtigt; siden opdagelsen i 2012 [25] er teknologien ændret fra at være et værdifuldt laboratorieværktøj til at blive en klinisk godkendt behandling med overbevisende effekt, herunder som behandling for SCD [17, 18].

Trods betydelige fremskridt står vi i dag over for udfordringer som høje omkostninger og kompleksitet af ex vivo-genterapi med tilhørende behov for specialiserede faciliteter og ekspertise. Adgangen til disse avancerede behandlinger er begrænset i lavindkomstlande, hvor sygdomsbyrden er størst. For at realisere det fulde potentiale af CRISPR-baseret genterapi er der behov for yderligere forskning og strategier, der kan gøre behandlingen mere tilgængelig og økonomisk overkommelig globalt.

Udvikling af in vivo-genterapi, hvor en enkelt infusion af et genterapiprodukt kan redigere hæmatopoietiske stamcellers DNA direkte i kroppen uden konditionering, tegner til på sigt at revolutionere feltet yderligere [26, 27]. Der er håb om, at dette vil bringe os et skridt nærmere en funktionel kur for hæmoglobinsygdomme og muliggøre skalering af behandlingen, så man kan imødekomme det globale behov.